БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.6, c.917-921
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 577.3
ВЛИЯНИЕ МУТАЦИИ Arg91Gly НА ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ
Р-ТРОПОМИОЗИНА
© 2008 г. И .А. Невзоров*, Ч.С. Редвуд**, Д.И. Левицкий* ***
*Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071, Москва, Ленинский просп., 33; E-m ail: nevzorov. ilya@gm ail. com E-mail: Levitsky@inbi.ras.ru **Отдел сердечно-сосудистой медицины, Оксфордский Университет, Оксфорд, Великобритания;
***Научно-исследователъский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119992, Москва, Воробъевы горы
Поступила в редакцию 26.06.08 г.
Исследовано влияние точечной мутации Arg91Gly в Р-тропомиозине, связанной с развитием дистального артрогрипоза - тяжелой формы наследственной патологии мышц на структуру и термодинамические параметры денатурации молекулы Р-тропомиозина. Методами дифференциальной сканирующей калориметрии и спектроскопии кругового дихроизма показано, что эта точечная мутация драматически снижает термостабильность значительной части молекулы Р-тропомиозина (около половины молекулы). Эта часть молекулы Р-тропомиозина с мутацией Arg91Gly плавится при ~28°C, т.е. при значительно более низкой температуре, чем остальная часть молекулы, которая денатурирует при ~40°C. Из сопоставления данных, полученных методом дифференциальной сканирующей калориметрии, с данными о ходе температурных зависимостей флуоресценции эксимеров пирена, снижение которой происходит при диссоциации двух цепей Р-тропомиозина в области пиреновой метки, присоединенной к остатку Cys36, сделан вывод о том, что этот тепловой переход отражает тепловую денатурацию всей N-концевой части молекулы Р-тропомиозина. При этом дестабилизирующее влияние мутации Arg91Gly распространяется на достаточно большое расстояние вдоль линейной молекулы тропомиозина, свидетельствуя об очень высокой кооперативности тепловой денатурации этой части молекулы Р-тропомиозина.
Ключевые слова: Р-тропомиозин, тепловая денатурация, дифференциалъная сканирующая калориметрия, круговой дихроизм.
Тропомиозины (ТМ) представляют собой многочисленное и крайне разнообразное семейство фибриллярных актинсвязывающих белков. Они играют важную роль в регуляции мышечного сокращения, а также в модуляции функций актинового цитоскелета в немышечных клетках. Молекула тропомиозина представляет собой димер, состоящий из двух цепей, каждая из которых обладает а-спиральной структурой. В результате их взаимодействия образуется двойная левая суперспираль, способная взаимодействовать с актиновым филаментом. В геноме млекопитающих и птиц обнаружено по четыре гена тропомиозина (а, Р, у и 5), которые дают более 30 изоформ за счет механизма альтернативного сплайсинга. Наибольшее распростра-
Сокращения: ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия, КД - круговой дихроизм, Р-ТМ - Р-тропо-миозин, Я910 - мутация А^9Ш1у в Р-ТМ.
нение в мышечных тканях имеют изоформы а-и Р-тропомиозинов [1].
В локусах генов тропомиозина известно большое количество точечных мутаций, наличие которых ассоциировано с развитием некоторых тяжелых заболеваний мышц. Известно, например, что мутация в гене Р-тропомиозина (Р-ТМ), вызывающая замену остатка А^91 на остаток глицина (мутация Я9Ш), связана с развитием дистального артрогрипоза - тяжелой формы наследственной патологии мышц [2].
В многочисленных исследованиях структуры а-тропомиозина, проведенных в том числе и в нашей лаборатории, было показано, что даже точечные мутации могут сильно сказываться на термостабильности белка, что может быть связано со значительными структурными перестройками в его молекуле [3,4]. В то же время почти ничего неизвестно ни об особенностях тепловой денатурации Р-ТМ, ни о влия-
нии точечных мутаций на термостабильность этого белка. В связи с этим, в настоящей работе проведено изучение тепловой денатурации ß-TM с использованием методов дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и кругового дихроизма (КД); при этом особое внимание было уделено вопросу о влиянии мутации R91G на термостабильность ß-TM. Для этого исследовали тепловую денатурацию рекомби-нантного ß-TM, несущего мутацию R91G, сопоставляя ее с денатурацией белка дикого типа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение белков. Рекомбинантный ß-TM дикого типа и его мутантную форму R91G экс-прессировали в штамме E.coli ВЬ21(ВЕ3)рЬуз8 в соответствии со стандартной методикой [5]. При выделении белка лизаты бактериальных культур нагревали до 95°С, а затем центрифугировали в течение 10 мин при 33200 g. Из полученного супернатанта ß-TM изоэлектриче-ски осаждали при рН 4,8 и подвергали дальнейшей очистке с помощью анионообменной хроматографии на колонке High-trap Q (Amer-sham) [6].
SH-группы в препаратах ß-TM восстанавливали, прогревая образцы в течение 40 мин при 60°С в присутствии 5 мМ ß-меркаптоэта-нола или 5 мМ дитиотреитола. Во всех экспериментах использовали предварительно восстановленный ß-TM.
Дифференциальная сканирующая калориметрия. Калориметрические эксперименты проводили на дифференциальном сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М (Институт биологического приборостроения РАН, Пущино) как описано ранее [7]. Образцы, содержавшие ß-TM (30 мкМ), 30 мМ HEPES (рН 7,3), 100 мМ KCl и 1 мМ MgCl2, прогревали с постоянной скоростью 1 К/мин от 10 до 70°С.
Круговой дихроизм. Температурные зависимости средней остаточной эллиптичности при 222 нм (0222) регистрировали на дихрографе Chirascan Ciroalar Didiroism Spectrometer (Ар-рНеё Photophysics) в кварцевой кювете с длиной оптического пути 2 мм в интервале от 5 до 60°C при скорости нагрева 1 K/мин, т. е. при той же скорости нагрева, что и в калориметрических экспериментах. Различия заключались лишь в том, что в экспериментах, проводимых методом кругового дихроизма, концентрация ß-TM была существенно ниже и составляла 2 мкМ, а буфер HEPES был заменен на 10 мМ калий-фосфатный буфер (pH 7,3), содержавший 100 мМ NaCl и 1 мМ MgCl2.
Температурные зависимости эксимерной флуоресценции пиренил-меченого ß-TM. Приго-
товление пиренил-меченого P-TM осуществляли по методике Лерера и соавт. [8]. Предварительно восстановленный P-TM инкубировали при 25°C в течение четырех часов с пятикратным молярным избытком пиренилйодацетамида (Moleralar ргоЬез) в среде, содержащей 5 M гуанидингидрохлорида, 1 мМ MgCl2 и 30 мМ HEPES (рН 7,0). Избыток непрореагировавшей метки удаляли с помощью гель-фильтрации на колонке NAP-5 (Pharmaria) и последующего диализа. Концентрацию меченого белка измеряли спектрофотометрически, используя молярный коэффициент экстинкции пиренилйодацетамида S344 = 2,2104 М-1-см-1 [8]. Общую концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд [9], используя в качестве стандарта а-тро-помиозин. Во всех случаях выход меченого белка составлял не менее 90%.
Температурные зависимости флуоресценции пиреновых эксимеров в препаратах P-TM регистрировали при длине волны, равной 485 нм, на флуоресцентном спектрофотометре Cary Ес-Нрзе (Varian, Australia), оборудованном температурным блоком, позволяющим поддерживать постоянную скорость нагрева, равную 1 К/мин.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Прежде всего мы исследовали тепловую денатурацию Р-ТМ дикого типа и его мутантной формы Я9Ш с помощью методов ДСК и КД. Сразу отметим низкую термостабильность Р-ТМ (температура максимума калориметрического пика для белка дикого типа составляет 40,5°С) (рисунок, а). Кроме того, следует отметить, что основному пику тепловой денатурации Р-ТМ предшествует некоторое низкокооперативное плавление, которое начинается при весьма низких температурах, с самого начала записи кривой ДСК (рисунок, а). Наличие такой некооперативной денатурации подтверждается и при исследованиях температурных зависимостей разворачивания а-спиралей Р-ТМ, регистрируемых методом КД (рисунок, б): хорошо видно, что денатурация начинается при очень низких температурах, с самого начала записи (~5°С). Природа этого процесса на сегодняшний день представляется дискуссионной. Из литературных данных [10] следует, что подобная некооперативная денатурация при низких температурах характерна для многих белков, имеющих структуру двойной а-спирали.
На кривых ДСК хорошо видно, что присутствие мутации Я9Ш оказывает сильное влияние на термостабильность Р-ТМ. Данный эффект выражается в появлении на термограмме нового пика с максимумом при 27,8°С (рисунок, а). Энтальпия этого нового перехода
ВЛИЯНИЕ МУТАЦИИ А^9Ш1у НА ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ
919
(площадь под данным пиком) составляет почти половину от общей калориметрической энтальпии тепловой денатурации Р-ТМ, что свидетельствует о дестабилизации существенного фрагмента молекулы вследствие точечной замены остатка А^91 на остаток глицина. Отметим, что присутствие мутации сказывается и на характере тепловой денатурации Р-ТМ, измеренной методом КД (рисунок, б). Кривая, отражающая утрату а-спиральной структуры при нагревании, в случае мутантной формы Р-ТМ имеет двухфазный характер, что также отражает дестабилизацию некоторой части молекулы.
Весьма интересно было установить границы распространения дестабилизирующего эффекта мутации Я9Ш. Для этого нами был применен подход, основанный на изучении температурных зависимостей флуоресценции эксимеров пи-рена [8]. Одиночные цепи Р-ТМ (как белка дикого типа, так и его мутантной формы) были помечены пиренилйодацетамидом по единственному в молекуле остатку цистеина Суз36. Суть данного подхода заключается в том, что в составе полностью свернутой молекулы тро-помиозина, состоящей из двух цепей, плоские ароматические остатки пирена образуют экси-мер, что сопровождается появлением в спектре флуоресценции пика с максимумом при 485 нм. Тепловая денатурация тропомиозина сопровождается диссоциацией его цепей, что приводит к закономерному тушению флуоресценции эк-симеров вследствие разрушения их структуры. На рисунке, в, представлены температурные зависимости флуоресценции эксимеров пирена, ковалентно присоединенного к остатку Суз36 в Р-ТМ дикого типа и в Р-ТМ с мутацией Я9Ш. Хорошо видно, что в случае мутантной формы Р-ТМ кривая убыли эксимерной флуоресценции см
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.