ГЕНЕТИКА, 2008, том 44, № 9, с. 1216-1226
ОБЩАЯ ГЕНЕТИКА
УДК 575.17
ВЛИЯНИЕ МУТАЦИОННО-ОБУСЛОВЛЕНИОГО ИЗБЫТОЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ МЕТАБОЛИТОВ КИНУРЕНИНОВОГО ПУТИ ОБМЕНА ТРИПТОФАНА В МОЗГУ САМЦОВ Drosophila melanogaster НА УСТОЙЧИВОСТЬ К СТРЕССУ ХАРАКТЕРИСТИК ИХ ПОВЕДЕНИЯ УХАЖИВАНИЯ И ЗВУКОВЫХ КОММУНИКАЦИОННЫХ СИГНАЛОВ
© 2008 г. А. В. Попов1, А. И. Переслени2, Е. В. Савватеева-Попова2, П. Ридерер3
1Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук, Санкт-Петербург 194223; e-mail: avpopov39@mail.ru 2Институт физиологии им. И.П. Павлова Российской академии наук, Санкт-Петербург 199034 3Клиника нейрохимии Отделения психиатрии Университета г. Вюрцбург,
Вюрцбург 97080, Германия Поступила в редакцию 17.05.2007 г.
Изучали устойчивость к тепловому шоку (ТШ, 37°С, 30 мин) характеристик поведения ухаживания и параметров звуковых коммуникационных сигналов самцов Drosophila melanogaster дикого типа (Canton S) и двух мутантных линий с дефектами в кинурениновом пути метаболизма триптофана: cinnabar (блок на уровне фермента кинуренин-3-гидроксилазы, приводящий к накоплению в мозгу нейропротективного метаболита - кинуреновой кислоты) и cardinal (блок на уровне фермента фе-ноксазинонсинтетазы, приводящий к накоплению в мозгу 3-гидроксикинуренина - генератора ок-сидативного стресса). В каждой линии самцов разбивали на 4 группы. Самцы контрольных групп не подвергались действию ТШ и служили контролем. Остальных самцов подвергали действию ТШ либо в конце эмбриональной-начале первой личиночной стадии развития, когда происходит формирование грибовидных тел мозга (группы HS1), либо на стадии предкуколки во время развития центрального комплекса мозга (группы HS2), либо на стадии имаго за час до опыта (группы HS). Самцов всех групп тестировали в возрасте 5 дней. Объектами ухаживания служили оплодотворенные и девственные 5-дневные самки CS. Показано, что характеристики поведения и пения самцов CS и cinnabar из контрольных групп очень сходны. Контрольные самцы cardinal обладают столь же высокой сексуальной мотивацией, но эффективность их ухаживания ниже из-за меньшей точности движений (часто вибрация крыльев не сопровождается звукоизлучением) и повышенной возбудимости. Предъявление ТШ на стадии личинки первого возраста практически не влияет на поведение и пение взрослых самцов всех изученных линий. У самцов cardinal, получивших ТШ на стадии предкуколки и особенно на стадии имаго за час до теста (группы HS2 и HS), резко нарушается поведение ухаживания и возникают разнообразные сильные искажения звуковых коммуникационных сигналов, свидетельствующие о нарушении координации активности элементов центра пения и их взаимосвязи с пейсмекерами. Подобные эффекты у самцов групп HS2 и HS линии дикого типа и особенно cinnabar либо отсутствуют вовсе, либо выражены значительно слабее. Таким образом, постоянный избыток 3-гидроксикинуренина в мозгу самцов резко снижает их устойчивость к стрессу. Напротив, избыток кинуреновой кислоты смягчает последствия стресса.
Биохимическая генетика началась в 30-40-х годах прошлого века с классических работ Бидла и Эффруси по установлению последовательных стадий кинуренинового пути обмена триптофана (КПОТ) у мутантов дрозофилы [1] и нейроспо-ры [2]. Этот путь обнаружен у многих видов, но детальнее всего изучен у насекомых (рис. 1). Изучение влияния на поведение гомологичных генов с известным биохимическим проявлением у представителей разных видов насекомых органично вписалось в исследования школы М.Е. Лобашева
и В.В. Пономаренко. Гомологичные мутации генов КПОТ дрозофилы и пчелы [3] были взяты в анализ задолго до завершения проектов Геном человека, дрозофилы и других видов, подтвердивших ранние представления М.Е. Лобашева [4, 5] о параллельном (гомологичном) развитии базовых функций нервной системы в ряду первично- и вторичноротых. Обнаружение нейрональной активности метаболитов КПОТ - возбуждающего действия кинуренина при его избытке, создаваемом либо при его введении нормальным пчелам,
v
Формилкинуренин
Триптофандиоксигеназа
Кинуренин-формадидаза
Кинуреновая кислота
Ксантуреновая кислота
Кинурерин
Антраниловая кислота
cn
-Кинуренингидроксилаза
3-гидроксиантраниловая кислота
3-гидроксикинуренин
cd
■ Феноксазинонсинтетаза
Оммохромы
Рис. 1. Схема кинуренинового пути обмена триптофана у дрозофилы с указанием мутаций, блокирующих определенные стадии превращения метаболитов.
либо у мутантов (см. обзоры [6, 7]), стимулировало развитие исследований на млекопитающих И.П. Лапина [8]. Его работы обратили внимание на противоположные - возбуждающие и тормозящие влияния на нервные функции метаболитов одного и того же пути [9]. С тех пор выяснено, что только около 1% триптофана в организме ката-болизируется с образованием медиатора серото-нина, тогда как 90% распада происходит по кину-рениновому пути. Конкурентные энзиматические реакции приводят к образованию из L-кинурени-на кинуреновой кислоты (KYNA), нейропротек-тивного метаболита, и нейротоксинов - 3-гидрок-сикинуренина (3-HOK) и хинолиновой кислоты. Повышенное содержание 3-HOK, генератора ок-сидативного стресса [10-12], является критическим фактором развития острых стрессорных состояний ишемии, гипоксии, инсульта, травм мозга, а также хронических нейродегенеративных заболеваний старения, таких, как болезни Альцгейме-ра (БА), Хантингтона (БХ) и Паркинсона (БП) [13]. Поэтому в экспериментальной клинической медицине ведут поиск и создание терапевтиче-
ских средств, способствующих либо увеличению содержания KYNA, либо снижению содержания 3-НОК. Для познания механизмов этиологии и патогенеза этих заболеваний и выработки стратегий их лечения необходимо привлечение модельных животных объектов, что полностью оправдано в свете последних данных сравнительной геномики. Мутанты насекомых представляют собой идеальный модельный объект [14], поскольку имеют постоянные, совместимые с жизнью отклонения в содержании метаболитов КПОТ в физиологических дозах. Мутации, приводящие к потере активности определенных ферментов пути, вызывают избыточное по сравнению с нормой накопление метаболитов КПОТ, предшествующих (up stream) мутационному блоку, и их отсутствие после него (down stream). Так, с применением мутанта дрозофилы cardinal (накопление 3-HOK) была создана модель, повторяющая основные клинические проявления нейродегенеративных болезней старения человека [15-17]. Мутации же КПОТ у млекопитающих не обнаруживались потому, что они не вызывают таких изменений
фенотипа, как у насекомых. Однако избыток метаболитов разных стадий КПОТ, секретируемых с мочой, был обнаружен достаточно давно [18] у пациентов с разными формами наследственно-обусловленной олигофрении. Кроме того, недавно выяснено, что и у человека 3-HOK является экранирующим пигментом глаза, УФ-фильтром. Связывание 3-HOK с белками хрусталика приводит к катаракте, изменяющей по мере старения цвет от белого до коричневого [19]. Так психиатрия обогатилась новейшими данными офтальмологии.
Тем не менее поведенческие корреляты действия метаболитов КПОТ изучены недостаточно. Поведение ухаживания у дрозофилы удобно для проведения таких исследований. Новый биоакустический метод Попова, Камышева и Озерского позволяет объективно оценивать мотивацию, нейромоторную координацию, состояние основных пейсмекеров и эффективность центральных отделов мозга в организации поведения, его соответствия контексту внешней ситуации [20]. Патологические отклонения в характеристиках поведения выражены значительно сильнее при действии стресса [21]. В качестве легко дозируемого и хорошо изученного на дрозофиле стрессорного воздействия [22] мы применяем тепловой шок. Кроме того, тепловой шок позволяет направленно модулировать функционирование определенных структур мозга в развитии [23].
Поэтому для изучения поведенческих коррелятов действия повышенного содержания в мозгу KYNA и 3-HOK мы использовали биоакустический метод на трех линиях D. melanogaster (диком типе, мутантах cardinal и cinnabar) подобно тому, как это сделано для оценки влияния этих факторов на процессы обучения и памяти [15].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экспериментальные животные. Мух вида Drosophila melanogaster содержали при 25 °С на стандартной изюмно-дрожжевой среде и световом цикле 12 : 12. Опыты проводили на взрослых 5-дневных самцах дикого типа (Canton S (CS)) и двух мутантных линий с дефектами в кинуренино-вом пути обмена триптофана (КПОТ): cinnabar (аллель cn1 с мутацией в структурном гене кину-ренингидроксилазы, блокирующей окисление ки-нуренина в 3-HOK [24, 25] и, таким образом, приводящей к увеличению на 100% содержания в мозгу KYNA [26]) и cardinal (аллель cd1 с мутацией, приводящей к снижению активности фермента феноксазенон-синтетазы и, вследствие этого, к увеличению в 2.9 раза содержания в мозгу 3-HOK [27-29]). Насекомых каждой линии разбивали на четыре группы. Самцов контрольных групп не подвергали тепловому шоку. Остальных самцов подвергали действию теплового шока либо в кон-
це эмбриональной-начале первой личиночной стадии развития (через сутки после откладки яиц), когда происходит формирование грибовидных тел мозга (группы ГО1), либо на стадии пред-куколки во время развития центрального комплекса мозга (группы ГО2), либо на стадии имаго в возрасте 5 дней за час до опыта (группы Ш).
Воздействие тепловым шоком. Для изучения эффектов теплового шока, подаваемого в течение развития дрозофил, взрослым мухам позволяли откладывать яйца в течение 5 ч. Затем родителей убирали. Стаканчики с вылупившимися личинками 1-го возраста или предкуколками помещали на 30 мин в водяную баню при 37°С. В случаях воздействия на взрослых мух их перед опытом переносили в предварительно подогретые сухие стаканчики, которые затем помещали в водяную баню при тех же условиях. Этим достигалось резкое включение теплового шока.
Методы оценки характеристик поведения ухаживания и параметров звуковых коммуникационных сигналов. В настоящей работе для оценки характеристик поведения ухаживания и параметров звуковых коммуникационных сигналов мы
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.