БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.6, c.943-949
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 577.322.23
ВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ, ИМИТИРУЮЩИХ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ТЯРМ7-КИНАЗОЙ, НА ФУНКЦИЮ ^КОНЦЕВОГО ДОМЕНА
ТРОПОМОДУЛИНА
© 2008 г. М.В. Доровков*, С.Н. Безноеов**, С. Шах***, Л. Котлянекая***,
А.С. Коетюкова** ***
*Кафедра фармакологии Университета медицины Нъю-Джереи, 675 Хоее Лэйн, Пиекатавэй,
Нью-Джерси, 08854, США; **Институт белка РАН, 142290, Пущино Московской области; ***Кафедра нейробиологии и клеточной биологии, Университета медицины Нью-Джерси, 675 Хоес Лэйн,
Пискатавэй, Нъю-Джерси, 08854, США Поступила в редакцию 26.06.08 г.
Показано, что тропомодулин 1 фосфорилируется ТЯРМ7-киназой по сериновым и треониновым остаткам. Определены сайты фосфорилирования для ТЯРМ7-киназы в К-концевом функциональном домене тропомодулина, содержащем тропомиозинсвязывающий и актинкэпирующий участки. Обнаружено, что мутация Т54Е, имитирующая фосфорилирование ТЯРМ7-киназой, приводит к потере способности К-концевого домена кэпировать актиновые филаменты, несмотря на сохранение способности связываться с тропомиозином. Предположено, что фосфорилирование тропомодулина ТЯРМ7-киназой может играть важную роль в регуляции динамики актиновых филаментов.
Ключевые слова: тропомодулин, ТЯРЫ7-киназа, актин, фосфорилирование.
Способность актина полимеризоваться и де-полимеризоваться играет важную роль в таких биологических функциях, как мышечное сокращение, миграция клеток и транспорт органелл. Актиновые филаменты полярны, их концы, медленно растущий (острый) и быстро растущий (тупой), отличаются по структуре и динамике полимеризации - деполимеризации. Существует около 160 различных актинсвязывающих белков, в функции которых входит кэпирование, стабилизация, связывание и разборка филамен-то в [1].
Тропомодулин - это уникальный кэпирую-щий белок с молекулярной массой около 40 кДа, способный специфически связываться с медленно растущим концом актиновых фила-ментов и ингибировать полимеризацию и деполимеризацию актина на этом конце [2,3]. Сродство тропомодулина к актиновым фила-ментам в отсутствие тропомиозина невысоко, но повышается в 1000 раз в его присутствии [4]. Несмотря на такое прочное связывание в экспериментах in vitro, кэпирование in vivo -это кратковременный и динамичный процесс. Как показано в работе [5], молекулы F-актина
Сокращения: ПЦР - полимеразная цепная реакция, ДСН - додецилсульфат натрия, ПААГ - полиакриламидный гель.
на остром конце тонких нитей в мышцах могут обмениваться со свободными молекулами 6-актина.
Функция тропомодулина критична на поздних стадиях миофибриллогенеза [6]. У мышей с «отключенным» геном тропомодулина прекращение развития миокарда приводит к летальности на эмбриональном этапе [7].
В настоящее время известны четыре изо-формы тропомодулина [8-10]. Изоформа Ттоё1, или Е(егу;Ьгосу;е)-Ттой, была обнаружена во многих тканях, но в основном находится в эритроцитах, в сердечных и скелетных мышцах. Изоформа Тшоё4, 8к(зке1е1а1)-Ттоё, была обнаружена в скелетных мышцах и замещает Ттоё1 в процессе их развития. Изоформа Ттоё2, Щпеигоп)-Ттоё, обнаружена в клетках мозга, а изоформа ТтоёЗ, Щи^ийош^Ттоё, была найдена во всех тканях.
В молекуле тропомодулина можно выделить два домена, существенно различающихся по структуре и функции. С-концевая половина (остатки 160-359) состоит из одного компактного, кооперативно плавящегося домена [11,12]. Пространственная структура этого домена представлена чередующимися а-спиралями и Р-структурами [13]. К-концевая половина (остатки 1-159), напротив, почти не структурирована [14-16]. Остатки 24-35 формируют а-спираль,
944
ДОРОВКОВ и др.
тогда как в остальной части N-концевого домена не определяется регулярная вторичная структура. N-концевой домен содержит сайты связывания с тропомиозином и актином, и его структурирование происходит при связывании с этими белками. N-концевой фрагмент тропо-модулина, Tmod1X-92, сохраняет способность кэ-пировать актиновые филаменты в присутствии тропомиозина, хотя и с меньшей эффективностью, чем полноразмерный белок [17].
Регуляция кэпирующей активности различных изоформ тропомодулина имеет большое значение для формирования цитоскелета и динамики актиновых нитей в мио фибриллах. Механизмы, с помощью которых может осуществляться такая регуляция, пока неизвестны. Возможно, существуют факторы, непосредственно влияющие на функцию тропомодулина за счет связывания с ним или его модификации. Фос-форилирование является одной из наиболее распространенных регулирующих модификаций белков. Ранее было обнаружено, что N-конце-вой серин (Ser2) в Tmodl может фосфорили-роваться в эритроцитах [18]. Однако киназа, ответственная за это фосфорилирование, не была найдена, и не было показано влияние этого фосфорилирования на функцию тропомодули-на.
Тропомодулин (изоформы Tmod2 и Tmod3) был обнаружен в лизате клеток нейробластомы N1E-115 среди белков, образующих комплекс с TRPM7 (van Leeuwen, личное сообщение). TRPM7 экспрессируется практически во всех тканях и представляет собой необычный бифункциональный белок, состоящий из TRP ионного канала с присоединенным а-киназным доменом [19,20]. Киназный домен TRPM7 принадлежит к недавно открытому семейству а-киназ [21,22]. Предполагается, что TRPM7 играет важную роль в гомеостазе Ca2+ и Mg2+. Наличие TRPM7 является обязательным для выживания клеток, он участвует в регуляции клеточного роста и пролиферации, клеточной адгезии, а также клеточной гибели во время аноксии [23]. Функциональная роль киназного домена TRPM7 до конца не ясна. Предполагается, что он обладает свойствами автофос-форилирования и авторегуляции, а также может фосфорилировать другие белковые субстраты. До недавнего времени только несколько белков были определены как субстраты этой киназы: аннексин I [24], ß-актин [25] и миозин IIA [26]. В данной работе мы показали, что TRPM7-ra-наза способна фосфорилировать тропомодулин 1. Мы определили аминокислоты, которые фос-форилируются в N-концевом фрагменте тропо-модулина, Tmod1^92, и исследовали влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование, на тропомиозинсвязывающие и актинкэпирующие
способности N-концевого домена тропомоду-лина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экспрессия и очистка белков. Экспрессия и очистка рекомбинантного TRPM7 киназного домена (ChaK1^at long) были выполнены, как описано в работе [20]. Тропомодулин и его N-концевые фрагменты (дикий тип и мутированные белки) были экспрессированы в Escherichia coli BL21(DE3^LysE согласно методу, описанному в работе [27], и очищены, как в [14] и [17]. Актин был выделен из ацетонового порошка, полученного из скелетных мышц цыпленка, как описано в [28]. G-актин очищали гель-фильтрацией на сефакриле S-300. Для детекции полимеризации актина с помощью флуоресценции часть G-актина ковалентно связали с флуоресцентной меткой пиренилиодоацетами-дом, как в работах [29,30].
Чистоту белков оценивали при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) [31]. Концентрации белков определяли при помощи BSA рго!еш assay kit (Pierce) или измерением разностного спектра в 6 М гуанидин-гидрохлориде при рН 12,5 и 7,0 [32] с использованием коэффициентов экстинкции 2357 для тирозина и 830 для триптофана [33].
Для изучения связывания тропомиозина и тропомодулина были использованы модельные химерные пептиды. Химерные пептиды состояли из N-концевых участков низко- и высокомолекулярных изоформ тропомиозина (остатки 1-19 и 1-14 соответственно) и 18 остатков так называемой «лейциновой застежки» из дрожжевого активатора транскрипции GCN4 [34]. Эти пептиды, а также высокомолекулярный мышечный а-тропомиозин, stTM, и низкомолекулярный немышечный а-тропомиозин, TM5a, были любезно предоставлены Сарой Хитчкок-ДеГрегори (RWJMS, Piscataway, NJ). Рекомби-нантный человеческий гельзолин был подарен Джоном Хартвигом (Brigham & Women's Hos-р^1 & Hematology Division, Boston, MA).
Конструирование плазмид. Направленный мутагенез проводили с использованием набора для мутагенеза QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA). Плазмиды были амплифицированы при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием ДНК-полимеразы PfuTurbo и наборов из двух комплементарных олигонук-леотидов, содержащих измененные триплеты. В качестве матрицы использовали плазмиду для экспрессии N-концевого фрагмента тропомоду-лина, рET(Нis)Tmod 1 (1 -92) [17]. После П^ матричную плазмиду расщепляли при помощи DpnI, и полученную смесь использовали для
(а)
-Tmod 1
1-92
0-
(б)
рН3.5
©
-ТЯРМ7-киназа -Tmodl
©
■Origin
p-Thr
р-Туг*-*
',»: p-Ser
1 ф
Tmodl
Tmodl
1-92
Рис. 1. Фосфорилирование тропомодулина TRPMV-киназой. Tmodl и его N-концевой фрагмент Tmodl^2 были икубированы с TRPMV-киназой и проанализированы при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ и радиоавтографии (а): 1 - Tmodl; 2 - TRPMV-киназа; 3 - Tmodl и TRPMV-киназа; 4 - Tmodl 1,92 и TRPMV-киназа. Фосфоаминокислотный анализ Tmodl (б) и Tmodl 1.92 (в) («origin» - место нанесения образца).
трансформации E. coli (max efficiency DH5a). Чтобы проверить наличие мутаций, очищенные плазмиды секвенировали. Синтез олигонуклео-тидов и секвенирование проводили в UMDNJ DNA Synthesis and Sequencing Facility (RWJMS, Piscataway, NJ).
Фосфорилирование и фосфоаминокислотный анализ. Киназную реакцию выполняли в фо^ форилирующей cмеcи: 50 мМ HEPES-KOH (рН 7,4), 10 мМ MgCl2, 4 мМ MnCl2, 0,5 мМ CaCl2, 100 мкМ АТФ и 2 мкКи [у-33Р]-АТФ (Perkin Elmer, cпецифичеcкая активно cть 3000 Ки/ммоль) c 0,1 мкг очищенного рекомбинант-ного TRPM7-киназного домена. Для реакции истользовали 0,5 мкг тропомодулина. Pеакции проводили при температуре 30°C в течение 15 мин и останавливали переношм в мокрый лед c добавлением электрофорезного буфера для образцов. Затем образцы инкубировали 5 мин при температуре 100°C и анализировали c помощью электрофореза в ДCH-ПААГ и радиоавтографии.
Для фоcфоаминокиcлотного анализа тропо-модулин или его фрагмент, фоcфоpилиpован-ный, как оптоано выше, c повышенным количеством радиоактивного АТФ, 10 мкКи [y-33P]-АТФ, разделяли электрофорезом в ДCH-ПААГ c
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.