ш
УДК 577.152.342*1134
ВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ В ИНСЕРЦИОННОМ ДОМЕНЕ АТР-ЗАВИСИМОЙ Lon-ПРОТЕАЗЫ ИЗ E. coli НА ЕЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ1
© 2015 г. А. М. Куджаев, А. Г. Андрианова, О. В. Серова, В. А. Архипова, Е. С. Дубовцева, Т. В. Ротанова#
ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 07.04.2015 г. Принята к печати 22.04.2015 г.
АТР-зависимая LonA-протеаза из E. coli (Ес-Lon), относящаяся к суперсемейству ААА+-белков, является ключевым участником системы контроля качества клеточного протеома. Ес-Lon функционирует как гомогексамер и расщепляет аномальные и дефектные полипептиды, а также ряд регуля-торных белков по процессивному механизму. Субъединица Ес-Lon включает АТР-азный и протео-литический компоненты (ААА+-модуль и Р-домен), а также уникальную для ААА+-белков некаталитическую область, образованную Ж-концевым (N) и инсерционным а-спирализованным (Н1(СС)) доменами. С целью выявления роли Н1(СС)-домена в функционировании фермента получены мутанты Ес-Lon с заменами остатков R164, R192 и Y294, локализованных в этом домене, и изучены их свойства. Показано, что С-концевая часть Н1(СС)-домена аллостерически влияет на эффективность функционирования АТР-азного и протеолитического центров фермента, а его coiled-coil(СС)-область вовлечена во взаимодействие с белковым субстратом.
Ключевые слова: ААА+-белки, АТР-зависимый протеолиз, Ьоп-протеазы, доменная организация, coiled-coil-область, сайт-направленный мутагенез, E. coli.
DOI: 10.7868/S0132342315050073
ВВЕДЕНИЕ
Семейство Ьоп-протеаз (КФ 3.4.21.53; МБЯОР8: клан 81, 816) играет ключевую роль в функционировании системы контроля качества белков (СКК), поддерживающей сохранность клеточного протеома во всех природных царствах [1, 2]. СКК включает в себя молекулярные шапероны, участвующие в ре-моделировании и дезагрегации клеточных белков, а также селективные АТР-зависимые пепти-дгидролазы, в том числе Ьоп-протеазы, которые освобождают клетки от дефектных и мутантных белков и, кроме того, подвергают деградации ко-роткоживущие регуляторные белки. Пептидгидро-лазы СКК — это олигомерные бифункциональные ферменты, протеолитические компоненты которых (Р-домены или индивидуальные субъединицы) представлены пептидазами разных классов, а АТР-азные компоненты — белками теплового шока
1 Статья публикуется по материалам сообщения, представленного на VII Российском симпозиуме "Белки и пептиды"; Новосибирск, 12—17 июля 2015 г. Список сокращений: AMPPNP — аденозин-5-(Р,у-ими-до)трифосфат, DTDP — 4,4'-дитиодипиридин, Nu — нук-леотид, РерТВЕ — Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl, СКК — система контроля качества белков.
# Автор для переписки (тел.: +7 (495) 335-42-22; факс: +7 (495) 335-71-03; e-mail: tatyana.rotanova@ibch.ru).
Hsp100, относящимися к суперсемейству ААА+-белков (АТР-азы, ассоциированные с различными клеточными активностями). К ААА+-белкам относятся также шапероны Clp/Hsp104, выполняющие в СКК функцию дезагрегации белков-мишеней [3].
Все белки семейства Hsp100 сформированы АТР-азными модулями (или ААА+-модулями) и экстрадоменами, локализованными либо на ^-конце белка (N-домен), либо внутри его ААА+-модуля (I-домен) [4]. Обычно ААА+-белки включают один или два АТР-азных модуля (соответственно белки классов II и I), каждый из которых состоит из двух доменов — нуклеотидсвязывающего (nucleotide binding, NB) и а-спирализованного (a-helical, Н), содержащих специфические консервативные элементы.
Lon-протеазы характеризуют как гомоолиго-мерные ферменты, ААА+-модули которых локализованы в единой полипептидной цепи с Р-до-менами [5], представленными серин—лизиновы-ми эндопептидазами [6]. Общий пул Lon-протеаз включает два подсемейства (А и В), при этом к А-подсемейству относятся цитоплазматические и митохондриальные ферменты бактерий и эукари-от, а к В-подсемейству — мембраносвязанные ферменты архей [7]. LonA- и LonB-протеазы различа-
A B
Ser679 Lys722
R164 R192 1
Ж-концевая область
Рис. 1. Доменная организация LonA-протеазы Е. coli. Обозначения доменов: N — Ж-концевой; Н1(СС) — а-спирали-зованный с coiled-coil-областью; NB — нуклеотидсвязывающий; Н — а-спирализованный; Р — протеолитический. Обозначения консервативных элементов: А и B — мотивы Уолкера, s1 и s2 — сенсорные остатки, R-f — остаток "арги-ниновый палец", Ser679 и Lys722 — каталитические остатки протеолитического центра. R164, R192 и Y294 — остатки, подвергнутые мутагенезу.
ются как окружением каталитических остатков се-рина и лизина, так и общей архитектурой субъединиц: ферменты LonA содержат Ж-конце-вой экстрадомен (N), а LonB — вставочный (I).
Характерной особенностью LonA-протеаз, отличающей их от других ААА+-белков, служит наличие пролонгированной вариабельной Ж-концевой области, предшествующей ААА+-модулям. Путем сравнительного анализа первичной и вторичной структур LonA-протеаз из отдаленных источников нами было установлено, что Ж-концевая область ферментов образована двумя доменами — истинным Ж-концевым (N) и "инсерционным" а-спи-рализованным (а-helical inserted, HI(CC)), который включает участок последовательности со специфической coiled-coil (СС) конформацией и проявляет выраженное сходство как с Н-доменом собственного ААА+-модуля, так и с а-спирализованным доменом (Н1(М)) первого ААА+-модуля шаперонов семейства ClpB/Hsp104 [8, 9]. Таким образом, доменная организация LonА-протеаз соответствует схеме N—HI(CC)—NB—H—P, где единственный нук-леотидсвязывающий домен (NB) фланкирован двумя подобными а-спирализованными доменами (HI(CC) и Н) (рис. 1). На этом основании LonА-протеазы можно считать уникальными представителями ААА+-белков, потенциально принадлежащими к классу I, но утратившими нуклеотидсвязы-вающий домен первого ААА+-модуля. При этом роль сохранившегося HI(CC)-домена в функционировании LonА-протеаз до сих пор остается невыясненной.
Целью настоящей работы явилось изучение влияния замен консервативных аминокислот, локализованных в различных фрагментах вставочного Ш(СС)-домена LonА-протеаз на функционирование и/или структурную организацию ферментов на примере LonА-протеазы из Escherichia coli (Ес-Lon, рис. 1). Для этого был проведен направ-
ленный мутагенез высококонсервативных остатков Я192 (СС-участок) и У294 (С-концевая часть домена) и охарактеризованы свойства полученных му-тантных форм фермента в сравнении со свойствами интактной Ес-Ьоп-протеазы, а также ранее полученного мутанта с заменой остатка Я164, локализованного в Ж-концевой части Н1(СС)-домена.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Инсерционные домены ЬопЛ-протеаз, Н1(СС), включают восемь а-спиралей — четыре спирали (Н1—Н4), формирующие собственно Н1-домен, и четыре спирали (С1—С4), образующие СС-участок. При этом фрагмент (С1—С4) локализован между спиралями Н3 и Н4, что соответствует следующей схеме вторичной структуры доменов: Н1-Н2-Н3-С1-С2-С3-С4-Н4 [9]. Далее следует линкерная зона, соединяющая Н1(СС)- и МВ-домены, которая также содержит а-спиральный фрагмент (Н-Ипк). Близкие по размеру Н1(СС)-домены (178—190 а.о.) проявляют выраженное сходство как в группе бактериальных ферментов, так и у ферментов эукариот [9]. СоИеё-еоИ-фрагменты (С1—С4) по степени подобия превосходят полноразмерные Н1(СС)-до-мены, а наиболее консервативным элементом СС-участков является "длинная" спираль С2, включающая 55 а.о. (показано на примере бактериальных ЬопЛ-протеаз, табл. 1). Для характеристики участия в функционировании фермента отдельных фрагментов Н1(СС)-домена Ес-Ьоп-протеазы (остатки 124—301) выбраны остаток СС-участка Лг§192 (консервативность 98%), локализованный в начале спирали С2, и остаток Туг294 (консервативность 95%) из С-концевой спирали Н4. Осуществлена точечная замена этих остатков на аланин и проведено исследование свойств мутантных форм Ьоп-Я192Л и Ьоп-У294Л в сравнении со свойствами интактного фермента, а
Таблица 1. Степени подобия Н1(СС)-домена (А), линкера к МВ-домену (В), СС-области (С), а также составляющих их спиралей (Н1—Н4, С1—С4 и Н-Ипк) для группы из 45 бактериальных ЬопА-протеаз
Фрагмент LonA-протеазы (размер, а.о.; Xaa-Yaa в Ec-Lon)
A (179 а.о., E123-V301) B (24 а.о., P302-Y325)
Спирали Обозначение Н1 Н2 Н3 С (108 а.о.; М173-М280) Н4 спираль Н-link
С1 С2 С3 С4
Размер спирали, а.о. (Хаа-Уаа в Ес-Ьоп) 22 (E124-N145) 10 (P149-H158) 11 (P162-H172) 5 (Q181-E185) 55 (V189-E243) 9 (E252-A260) 13 (E266-L278) 15 (A286-Q300) 12 (D311-T322)
Подобие спирали или фрагмента, % 9.1 0.0 18.2 40.0 52.7 0.0 30.7 33.3 33.3
П/р фрагменты (A, B и С) ( С) 31.5 (B) 33.3
(A) 24.6
П/р — полноразмерный.
также ранее полученного мутанта Ьоп-Я164А (из спирали Н3) [10].
Мутанты Ьоп-Я192А и Ьоп-У294А получали на основе рекомбинантной формы Ес-Ьоп, содержащей гексагистидиновый фрагмент на С-конце белка (С-Шз-Ьоп) [10]. Интактный фермент и его мутантные формы выделяли с помощью аффинной хроматографии на №-сефарозе и гель-фильтрации на сефакриле 8-400.
АТР-азная активность мутантных форм Ес-Ьвп-протеазы
Ранее было установлено, что условием проявления нативной bc-Lon-протеазой масимальной АТР-азной активности служит эквимолярное содержание АТР и ионов магния в реакционной среде при рН 8.0—8.2. В условиях, близких к физиологическим (повышенная концентрация ионов Mg2+), наблюдается ингибирование АТР-азной активности фермента, причем, эффект ингибирования нивелируется в присутствии белкового субстрата [11].
Все три мутантные формы C-His-Lon с заменами остатков в Н1(СС)-домене сохраняют способность к гидролизу АТР при соотношении концентраций АТР и Mg2+ в среде 1 : 4 (рис. 2), при этом любая мутация приводит к значительному снижению активности фермента, наиболее выраженному у формы Lon-Y294A (потеря активности составляет 95%). В присутствии белкового субстрата АТР-азная активность интактного фермента и его мутантов возрастает в разы (рис. 2). Приведенные данные свидетельствуют о том, что Н1(СС)-до-мен не важен для формирования АТР-азного центра Ес-Lon-протеазы, но влияет на эффективность его функционирования.
Активность пеп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.