МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 82, № 4, с. 395-401
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 541.123:546.21 '231 '832+577.214.622
ВЛИЯНИЕ NAD+-ЗАВИСИМОЙ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ НА АНАЭРОБНОЕ ДЫХАНИЕ ЗИЕЦШЕИЛ ОШЮЕЖШ MR-1
© 2013 г. Н. Н. Мордкович*,1, Т. А. Воейкова**, Л. М. Новикова**, И. А. Смирнов***, В. К. Ильин***, П. Е. Солдатов***, А. Ю. Тюрин-Кузьмин***, Т. С. Смоленская***, В. П. Вейко*, Р. С. Шакулов**, В. Г. Дебабов**
*Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук, Москва
**ФГУПГосударственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных
микроорганизмов, Москва
***Институт медико-биологических проблем Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 06.12.2012 г.
Сконструирована экспрессионная плазмида и проведена гетерологичная экспрессия гена NAD+-3a-висимой формиатдегидрогеназы (ФДГ) из метилотрофной бактерии Moraxella sp. в клетках Shewanella oneidensis MR-1 в аэробных и анаэробных условиях. Активность рекомбинантной ФДГ была выявлена в клеточном лизате трансформантов при обоих условиях культивирования клеток. Интенсивность анаэробного дыхания, определенная по скорости конверсии акцептора электронов — фумарата, в сукцинат на среде с лактатом в качестве источника углерода у трансформанта с рекомбинантной ФДГ возрастала. При культивировании трансформанта S. oneidensis MR-1 с ФДГ в анаэробных условиях в микробном топливном элементе (МТЭ) обнаружено повышение уровня плотности тока.
Ключевые слова: микробные топливные элементы, МАБ+-зависимая формиатдегидрогеназа, анаэробное дыхание, 8кеугапе11а oneidensis МЯ-1.
DOI: 10.7868/S002636561304006X
Факультативно анаэробная электрогенная бактерия S. oneidensis MR-1 относится к классу у-про-теобактерий (порядок Alteromonadales). Бактерии этого вида способны восстанавливать нерастворимые окислы металлов, что делает их перспективными в процессах биоремедиации загрязнений почв и водоемов [1]. Способность S. oneidensis MR-1 к передаче электронов на внешнюю мембрану в процессе анаэробного дыхания за счет значительного числа мультигемовых цитохромов, а так же широкий спектр акцепторов электронов, позволяет использовать S. oneidensis MR-1 в микробных топливных элементах [2, 3].
Установленная полная последовательность генома S. oneidensis MR-1 позволяет рассматривать данный микроорганизм как объект для проведения генно-инженерных манипуляций, направленных, прежде всего, на увеличение его потенциала в качестве основного компонента в МТЭ [4]. Сравнительно недавно в литературе появились данные об использовании штамма S. oneidensis MR-1 в качестве реципиента при ге-терологичной экспрессии различных генов с ис-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: serkovan@mail.ru).
пользованием плазмидных векторов, разработанных для E. coli [5, 6]. Нами была показана возможность использования промотера гена udp из E. coli для гетерологичной экспрессии в S. oneidensis MR-1 в аэробных и анаэробных условиях [7].
Целью настоящей работы была интенсификация процесса анаэробного дыхания путем увеличения биосинтеза NADH эквивалентов. Для этого в клетках S. oneidensis MR-1 была осуществлена гетерологичная экспрессия гена fdh NAD+^ави-симой формиатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.2, ФДГ) из метилотрофной бактерии Moraxella sp. под контролем промотер-операторной области гена уридин-фосфорилазы (udp) из E. coli в аэробных и анаэробных условиях. При культивировании в анаэробных условиях был исследован уровень восстановления фумарата в сукцинат в разные временные интервалы и уровень плотности тока в МТЭ при культивировании трансформанта с ФДГ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы и плазмиды. Штамм E. coli JM110 получен из ВКПМ ФГУП ГосНИИГенетика. Штамм S. oneidensis MR-1 получен из коллекции микро-
Таблица 1. Олигонуклеотиды, использованные в работе
№ Название Последовательность 5'-3' Сайт
1 FDB ATATAGATCTATGGCCAAGGTTGTTTGCGTT BglII
2 FDX ATATCTCGAGTCAGGCGTCGAGCTTTTCGT XhoI
Подчеркнуты искусственно введенные сайты рестрикции.
организмов Института Пастера (№ CIP106686, Франция). Плазмида pER, содержащая ген устойчивости к канамицину и промотер-операторную область гена udp из E. coli, сконструирована в лаборатории ранее [7]. Вектор pFDH, содержащий клонированную последовательность гена NAD+^ави-симой формиатдегидрогеназы из Moraxella sp., любезно предоставлен Тишковым В.И. (МГУ им. М.В. Ломоносова).
Среды и условия культивирование клеток. Культивирование штамма E. coli проводили при 37°С в жидкой либо на агаризованной среде Луриа-Бер-тани (LB) [8]. Для обеспечения селективного роста клеток E. coli, содержащих плазмиду, использовали ампициллин в концентрации 150 мкг/мл. Культивирование S. oneidensis MR-1 проводили в жидкой или на агаризованной среде TSB (Tryptic Soy Broth, "Sigma", США): 40 г среды на 1 л дистиллированной воды, при 30°С. Для обеспечения селективного роста клеток-трансформантов использовали канамицин в концентрации 50 мкг/мл. Анаэробное культивирование S. oneidensis MR-1 проводили на среде TSB или минимальной среде (ММ) [9] c добавлением лактата натрия в качестве источника углерода в концентрации 2.0 г/л и с добавлением фумарата натрия в качестве акцептора электронов в концентрации 2.4 г/л в стерильных пластиковых пробирках Falcon объемом 15 мл [9]. При анаэробном культивировании клетки трансформантов предварительно выращивали аэробно для накопления биомассы в течение 18 часов и затем переносили в свежую среду для культивирования в анаэробных условиях. Концентрацию формиата натрия при культивировании клеток варьировали в пределах 0-10 г/л. Культивирование в МТЭ осуществляли на среде ММ с добавлением лактата натрия в концентрации 4 г/л и кана-мицином.
Подготовка штаммов S. oneidensis MR-1 для МТЭ. Биомассу трансформантов, содержащих плазмиды pERFDH и pER (K-) S. oneidensis MR-1 (далее S. oneidensis MR-1/pERFDH и S. oneidensis MR-1/pER), выращивали аэробно в колбах объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды TSB с кана-мицином, на круговой качалке при 240 об/мин в течение 18 ч. Затем культуры центрифугировали при 6000 g в течение 20 мин, осадок биомассы собирали, промывали физиологическим раствором и вторично центрифугировали в тех же условиях. Полученную биомассу переносили в синтетиче-
скую среду с необходимыми добавками, уравнивали по оптической плотности и стерильно переносили в МТЭ. Титр живых клеток определяли, рассевая полученную рабочую суспензию на чашки Петри со средой TSB в соответствующих разведениях.
Определение содержания органических кислот в культуральной жидкости. Пробы для определения содержания органических кислот (фумарат, лак-тат, формиат, сукцинат) при анаэробном культивировании отбирали в интервалы времени, определяемые задачами эксперимента. Аликвоты по 1 мл центрифугировали 10 мин при 10000 g, и определяли содержание органических кислот в надоса-дочном растворе. Анализ проводили на приборе для высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) Waters, модель Allyans ("Waters", США); колонка С18, 250 х 4.6 мм, 5 мкм; элюент — фосфорная кислота (0.1%), ацетонитрил (0.5%), метанол (0.5%). Скорость потока 1 мл/мин. Регистрацию элюатов осуществляли при длине волны 210 нм. Данные, полученные на основе трех независимых экспериментов, представлены как среднее и стандартное отклонение для каждой серии экспериментов. Статистическую обработку проводили по трем независимым экспериментам с использованием программы "StatPlus2007".
Манипуляции с ДНК. Выделение, очистку ДНК, расщепление рестриктазами, лигирование и трансформацию клеток E. coli плазмидной ДНК проводили согласно [8]. Трансформацию клеток S. oneidensis MR-1 плазмидной ДНК проводили, как описано в [6].
Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе Eppendorf Mastercycler gradient (" Eppendorf", Германия) в объеме 20—25 мкл при 2— 3 мМ MgCl2, 0.125-0.2 мМ каждого из dNTP, 67 мМ Tris-HCl (pH 8.3), 16.5 мМ (NH4)2SO4, 0.5 ед. Taq-полимеразы, 1-10 нг ДНК, 5 пмоль каждого праймера. Режим амплификации (°С/с): 95/120 — 1 цикл; 95/10, 60/10, 72/20 — 25—30 циклов; 72/180 — 1 цикл.
Синтез олигодезоксирибонуклеотидов. Синтез проводили на автоматическом синтезаторе ASM-800 ("БИОССЕТ", Россия) и очищали согласно [10]. Структуры синтетических олигонук-леотидов, использованных в работе, представлены в табл. 1.
Fe(III) Fe(II)
Рис. 1. Общая схема передачи электронов в электрон-транспортной цепи S. oneidensis MR-1 в процессе анаэробного дыхания при утилизации лактата. Пунктирной стрелкой обозначен альтернативный путь окисления формиата при ге-терологичной экспрессии NAD+- зависимой формиатдегидрогеназы. ЦМ — цитоплазматическая мембрана, ПМ — периплазматическая мембрана, CymA — тетрагемовый цитохром, FccA — фумаратредуктаза, MQ — менахиноны, FDH — NAD-независимая формиатдегидрогеназа, rFDH — рекомбинантная NAD+-зависимая формиатдегидрогеназа из Moraxella sp.
Первичную структуру ДНК определяли методом циклического секвенирования по Сэнгеру с использованием автоматического секвенатора "Beckman Coulter" (США) в Центре коллективного пользования ФГУП ГосНИИГенетика.
Разрушение клеток проводили с помощью ультразвукового дезинтегратора Ultrasonic Processor ("Cole Parmer", США).
Определение активности ФДГ проводили согласно [11]. Статистическую обработку проводили по трем независимым экспериментам с использованием программы "StatPlus2007".
Определение концентрации белка осуществляли по методу Бредфорд [12].
Характеристика МТЭ. В работе использовали микробный топливный элемент МТЭ1, представляющий двухкамерную ячейку с катион-обменной мембраной MK-40 (ОАО "Щекиноазот", Россия). Объем каждой ячейки составляет 295 см3, размер углеродных электродов: анод 64.0 см2, катод 15.5 см2. Анод и катод соединены электрической цепью с ре-
зистивной нагрузкой 150 кОм. Регистрация параметров проводилась в течение всего эксперимента с использованием программы LabView (США). Стабильность работы ячеек и воспроизводимость показателей МТЭ1 описана в работе [13].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Бактерия 8. oneidensis МЯ-1 широко используется для изучения механизмов анаэробного дыхания, а так же производства эл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.