БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 2, с. 234-241
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА
УДК 575.1/.2:612.017:504.054
ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА И ДИОКСИДА ТИТАНА НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ МАРКЕРОВ ВО СПАЛЕНИЯ И АПОПТОЗА
© 2015 г. Л.А. Баранова, Е.В. Жорник, И .Д. Волотовский
Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, 220072, Минск, ул. А кадемическая, 27
E-mail: r344@ibp.org.by Поступила в p едакцию 15.01.15 г.
C целью оценки токcичеcкого действия наночастиц cеpебpа и двуокиси титана было изучено влияние наночастиц на экcпpеccию генов биомаpкеpов воcпалительныx pеакций и апоптоза в лимфоцитах человека. Установлено увеличение экcпpеccии генов ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-а и p53 по критерию тpанcкpипции в диапазоне концешраций наночаcтиц cеpебpа и диоксида титана 10-40 мкг/мл. Увеличение экспрессии генов ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНО-а свидетельствует об активации иммунной системы, а гена р53 - о стимуляции апоптоза.
Ключевые слова: наночастицы серебра, наночастицы диоксида титана, лимфоциты, экспрессия генов ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-а и р53.
Новые материалы, компоненты и системы, получение которых основано на использовании различных нанотехнологий, находят широкое применение в различных отраслях народного хозяйства и медицины.
В медицине наноматериалы используются для целей транспорта лекарственных средств, а наночастицы окиси титана и серебра - в шовных и перевязочных материалах, при создании биосовместимых имплантатов и др. [1]. Оксид титана находит также широкое применение пр и производстве красок, пластмасс, зубной пасты. В косметической продукции окись титана используется в солнцезащитных кремах для защиты от УФ -излучения [2]. Учитывая, что контакт человека и других биологических объектов с наноматериалами все время увеличивается, изучение вопросов потенциальных рисков их использования представляется первостепенной задачей, особенно, если речь идет о человеке.
Обусловлено это тем обстоятельством, что в форме наночастиц различные материалы при-обр етают новые, не присущие им способности индуцировать биологические эффекты. Наночастицы проникают в р азличные типы клеток и способны к тр ансцитозу через эпителиальные и эндотелиальные клетки, могут распространяться в организме по ходу дендритов и аксо -
Сокращения: AgNP - наночастицы серебра, ТЮ2 - наночастицы двуокиси титана.
нов, кровеносных и лимфатических сосудов [3]. Размеры наночастиц, которые могут взаимодействовать с клетками живого организма, со -измеримы с их мембранными структурами и внутриклеточными компонентами, что, по-видимому, и определяет особенности внутриклеточных пр оцессов, протекающих с их участием.
В связи с опасностью проявления токсических свойств используемых наночастиц представляется актуальным изучение молекулярных механизмов их цитотоксичности и связанного с ней риска негативного воздействия на ор га-низменном и клеточном уровнях.
Взаимодействие наночастиц с клеткой может происходить или на уровне ДНК, или на уровне мембран. Актуальным является исследование генетических аспектов воздействия наноструктур на клетку, поскольку в этом случае повреждающее действие наночастиц может про -являться либо в виде отдаленных эффектов (мутагенность, генотоксичность), либо через влияние на экспрессию различных генов, включая гены таких важнейших белков-маркеров, как биомар керы окислительного стресса, воспалительных реакций, апоптоза.
Большинство проводимых в настоящее вр е-мя исследований посвящено изучению влияния искусственных наночастиц при их ингаляционном воздействии [3,4], а также пр и попадании на кожу [5]. Хотя, как упоминалось выше, наночастицы способны продвигаться вдоль эпителия респираторного тракта и по лимфатиче-
ской системе, проникая в кровоток с последующим системным распределением в организме [6], исследований по изучению их влияния на клетки крови относительно мало.
Популяция лимфоцитов периферической крови человека является одним из основных компонентов иммунной системы и участвует в формировании в организме практически всех иммунных ответов. Важная роль в возникновении иммунного ответа клеток принадлежит цитокинам - молекулам-посредникам межклеточных взаимодействий, регулирующим кроветворение, клеточный цикл, апоптоз [7]. Стимуляция клеток цитокинами индуцирует в свою очередь экспрессию ядерного фактора КР-кБ, который играет ключевую роль в реализации апоптотического сигнала [8].
Согласно существующей в настоящее время гипотезе о взаимодействии наночастиц с поверхностью клетки пр едполагается, что начальным событием их воздействия на клетку является окислительный стресс, который приводит к запуску сигнального каскада воспалительных реакций и апоптоза с участием интерлейкинов и фактора некроза опухоли (ФНО-а), которые играют ключевую роль в контроле важных функций организма [9,10]. Инициатором окислительного стресса являются активные фор мы кислорода, которые могут выступать в роли как цитотоксического, так и генотоксического фактора [11,12].
После контакта с клеточной мембраной со -бытия могут развиваться по одному из веро-ятных путей: наночастицы ^ окислительный стресс ^ нарушение окислительно-восстановительного баланса ^ сигнальные пути МАРК ^ транскрипционные факторы КР-кБ, АР-1 ^ воспалительные реакции. Однако внутриклеточные медиаторы этих реакций могут значительно отличаться для разных наночастиц. Мембранный состав, мембранные домены или рафты, экстраклеточный белковый матрикс оказывают значительное влияние на последовательность событий после взаимодействия наночастиц с мембраной. Окислительный стресс, инициируемый наночастицами, активирует транскрипционный фактор КР-кБ через отсоединение ин-гибиторной единицы 1кБ, в результате чего происходит транслокация КР-кБ в ядро, где КР-кБ индуцир ует транскр ипцию провоспали-тельных цитокинов, что в конечном счете приводит к воспалительной реакции [13].
К биомаркерам токсичности можно отнести КО-синтазу, белок теплового шока И8Р70Б, полифункциональный белок р53, выступающий в роли маркера апоптоза, маркеры воспали-
тельных реакций интерлейкины (ИЛ-6, ИЛ-8) и фактор некроза опухоли (ФНО-а) [14].
Для всесторонней оценки токсичности на-номатериалов необходимо проводить скр ининг их токсичности по ключевым пар аметрам: физико-химической характеристике наночастиц, а также анализу их эффектов in vitro и in vivo. Кроме того, важно оценить возможность таких системных ответов клетки на действие наноча-стиц, как окислительный стресс и воспалительная р еакция.
Вопрос о влиянии наночастиц на экспрессию генов биомаркеров важнейших клеточных процессов остается малоизученным, в связи с чем актуальность данной проблемы очевидна и наши исследования были направлены на выяснение молекулярно-генетических механизмов токсичности наночастиц.
Целью работы является исследование воздействия наночастиц серебра (AgNP) и наночастиц диоксида титана (TÍO2) на экспрессию генов биомаркеров воспалительных реакций и апоптоза в лимфоцитах человека.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объектов исследования использовали лимфоциты периферической крови здоровых доноров, полученной в Республиканском научно-практическом центре трансфузиологии и медицинских биотехнологий. Наночастицы серебра размером 5-20 нм были изготовлены в Институте технологии окружающей среды Вьетнамской академии наук и технологии методом обратного мицеллообразования. Метод обратного мицеллообразования основан на образовании наночастиц в системе водно-углеводной микроэмульсии в присутствии поверхностно-активного вещества. Форма мицелл зависит от геометрического соотношения P [15]:
P = v/(a ■ l),
где l, v — длина и объем гидрофобного хвоста углевода, a — попер ечное сечение гидрофильной головки углевода.
При производстве наночастиц AgNP использовали AgNO3 в качестве источника ионов серебра, хитозан - в качестве стабилизатора, NaBH4 и кверцетин - как восстановители, С ТАВ (бромистый цетилтриметиламмоний), SDOSS (диоктилсульфо сукцинат натрия) и АОТ (бис(2-этилгексил)сульфосукцинат) - как поверхностно-активные вещества [16]. На микро -фотографии наночастицы сер ебра выглядят в виде круглых пятен с диаметром от 5 до 20 нм (рис. 1).
Рис. 1. Микрофотография наночастиц серебра, полученных методом обратного мицеллообразования.
В экспериментах также использовали ком-мер ческий препарат наночастиц диоксида титана размером ~ 21 нм (Sigma, США).
Получение лимфоцитов проводили согласно стандартной методике выделения мононуклеа-ров периферической крови в градиенте плотности смеси фиколл-урографин [17].
РНК выделяли из лимфоцитов перифер иче-ской кр ови с помощью набор а GeneJet RNA рипйсайоп kit (Fermentas, Литва). После этого осадок промывали 70% спиртом, осаждали, подсушивали, растворяли в 40 мкл воды и использовали для синтеза кДНК. Далее измеряли концентрацию РНК на приборе ^поБгор 2000. Доведя ее концентрацию до 150 нг/мкл, на матрице РНК методом обр атной транскрипции с oligo(dT) праймер ами получали кДНК в со -ответствии с протоколом производителя (Fermentas). После синтеза кДНК измеряли кон-
центрацию полученного продукта и пр оводили выр авнивание концентрации кДНК в образцах по поглощению при X = 260 нм.
Обработку лимфоцитов наночастицами про -водили в С02-инкубаторе при 37°C в питательной среде RPMI 1640, содержащей 0,3 мг/мл L-глютамина, 5 мМ HEPES-буфера, 10% инак-тивированную бычью сыворотку, пенициллин (100 U/мл) и стрептомицин (100 U/мл). По истечении времени воздействия лимфоциты отмывали от наночастиц.
Уровень экспрессии генов определяли по критерию тр анскрипции при проведении ПЦР в реальном времени. Для количественной оценки полученных результатов использовали анализ экспрессии генов методом 2-AACt [18].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
C целью изучения экспрессии генов, вовлеченных в процессы, связанные с сигнальной трансдукцией воспалительных реакций и апоп-тоза, инициируемых наночастицами, проведен анализ структуры генов ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-а и р53. В базе данных GenBank были выбр аны нуклеотидные последовательности, соответствующие мРНК исследуемых генов человека: M54894.1 - ИЛ-6, NM_000584.3 - ИЛ-8, AB082923.1 - р53 и NM_000594.3 - TNF-а. На основе анализа их нукл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.