ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.132
ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА НА ПАРАМЕТРЫ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛОРОФИЛЛА И РЕАКЦИИ Р700
зеленой водоросли снымутмотб кетнлявтп
© 2014 г. Д. Н. Маторин*, Д. А. Тодоренко*, Н. X. Сейфуллина*, Б. К. Заядан**, А. Б. Рубин*
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет **КазНУим. аль-Фараби, г. Алматы, Казахстан Поступила в редакцию 18.06.2013 г.
На флуориметре М-РЕА2 проведены исследования острой токсичности наночастиц серебра (^НЧ) на фотосинтез Chlamydomonas гвткаМШ. Анализ индукционных кривых флуоресценции в присутствии низких концентраций ^НЧ показал ингибирование электронного транспорта в ФС2 и увеличение доли QB — невосстанавливающих центров. Обнаружено влияние на процессы энергизации фотосинтетических мембран и отсутствие прямого действия на реакции окисления пигмента ФС1 - Р700. Предлагается использовать параметры индукционных кривых быстрой и замедленной флуоресценции для раннего обнаружения появления ^НЧ в среде.
Ключевые слова: Chlamydomonas reinhardtii, наночастицы серебра, флуоресценция хлорофилла, фотосинтез, экология.
БОТ: 10.7868/80026365614010108
В настоящее время при изготовлении различных товаров все шире используют серебросодер-жащие материалы, в том числе и металлические наночастицы серебра (AgH4). К таким продуктам производства относятся: ткани, воздушные фильтры, косметические средства, зубные пасты, товары для детей, пылесосы и стиральные машины [1]. Появилось большое количество серебросодержащих медицинских препаратов, которые обладают антимикробными свойствами благодаря наличию в них ионов серебра [2].
В течение длительного времени считалось однозначно доказанным, что лечебными свойствами обладают ионы Ag+, а не металлическое серебро. Тем не менее, вопрос о механизме действия наночастиц серебра на различные биообъекты до настоящего времени остается окончательно не выясненным и требует дополнительных исследований [2]. Токсичность ионов серебра для водорослей изучена в ряде работ [5, 6]. Токсичное действие AgH4 на пресноводные водоросли Chlamydomonas reinhardtii показано в работе [7, 8]. Обнаружено, что AgH4 способны ингибировать фотосинтез у
1 Автор для корреспонденции (e-mail: matorin@biophys. msu. ru). Сокращения: наночастицы серебра — AgH4; ФС2 — фотосистема 2, РЦ — реакционный центр, QA — первичный, QB — вторичный хинонные акцепторы электрона, PQ -пластохи-нон, О, J, I, P — промежуточные стадии в светоиндуцирован-ной кривой флуоресценции; ЗФ — замедленная флуоресценция; Р700 — пигмент РЦ ФС1.
природного фитопланктона, который является основой биопродуктивности водоемов [4].
Существует высокая вероятность того, что А§НЧ могут попасть в водные экосистемы и стать источником растворенного серебра, что, возможно, окажет токсическое действие на водные организмы [3, 4].
В токсикологических опытах на микроводорослях используются флуоресцентные методы, поскольку они являются наиболее удобным методом, который позволяет следить за процессами фотосинтеза, и дают подробную информацию о начальных нарушениях клеточного метаболизма в основном на мембранном уровне [4, 9, 10]. Кроме того, такие методы позволяют получить информацию о состоянии природного фитопланктона в режиме реального времени. Хлорофилл, находящийся в фотосинтетических мембранах водорослей, служит своего рода природным датчиком фотосинтетической активности клеток за счет испускания квантов флуоресценции. Измерение соотношения интенсивности флуоресценции при насыщающем фотосинтез свете (¥т) и в условиях, не вызывающих изменений состояния фотосинтетического аппарата (¥0) (низкая интенсивность света), позволяет определить максимальную эффективность процессов фотосистемы 2 (ФС2), которая равна (^ - = Параметр представляет собой безразмерную энергетическую
£ о о Я m Я о Я
8 я S
14 12 10
8 -6 -
4 -
10 100 Размер частиц, нм
1000
Рис. 1. Гистограмма размера наночастиц серебра, измеренная на приборе Zetasizer Nano ZS.
характеристику фотосинтеза, аналогичную коэффициенту полезного действия и не зависящую от видовой специфики организма.
В последнее время для оценки работы фотосинтетического аппарата высших растений и культур водорослей, начинают использовать методы измерения индукционных кривых флуоресценции с высоким временным разрешением (от 10 мкс) при возбуждении интенсивном свете [11— 15]. Измерение индукционных кривых флуоресценции с высоким разрешением занимает всего несколько секунд и проводится на приборах типа РАМ и PEA. На приборе М-РЕА2 появилась возможность наряду с регистрацией флуоресценции измерять изменения поглощения Р700 (пигмента ФС1). То есть прибор позволяет одновременно следить за отдельными реакциями ФС1 и ФС2 [11, 12]. Более того, прибор регистрирует индукционные изменения замедленной флуоресценции, которые дают информацию о кинетике электрохимического градиента протонов на фотосинтетической мембране [4].
В настоящей работе на флуориметре М-РЕА2 проведены исследования процессов ФС1 и ФС2 и электрохимического градиента протонов на тила-коидной мембране водоросли Chlamydomonas rein-hardtii после воздействия на них наночастиц серебра в концентрациях, вызывающих незначительные изменения величины отношения Fv/Fm.
Целью данной работы явилось изучение возможности применения анализа быстрых кине-тик флуоресценции хлорофилла для оценки состояния фотосинтетического аппарата водорослей на ранних стадиях токсического воздействия наночастиц серебра.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объекта исследования были выбраны зеленые водоросли Chlamydomonas reinhardtii Dang cl37+, выращиваемые фототрофно на трис-ацетат-фосфатной среде. Культивирование проводили накопительным методом при освещении 30 мкЕ/м2 и температуре (18—20°С). Начальная плотность культуры составила 300 тыс. кл./мл. В опытах использовали культуры стационарной фазы роста. Численность клеток водорослей была определена микроскопическим методом подсчета клеток с помощью камеры Горяева.
Измерения флуоресцентных показателей водорослей проводили на приборе М-РЕА2 ("HansaTech", Англия), который позволяет проводить одновременно регистрацию индукций быстрой и замедленной флуоресценции, а также изменений Р700 по поглощению при длине 820 нм с высоким временным разрешением (начиная с 0.01 мс). Регистрация быстрой и замедленной флуоресценции производится при чередовании актинич-ного света (627 нм, 1200 мкЕ/м2с) и темновых интервалов. Перед измерением образцы водорослей концентрировали на мембранном фильтре, затем отфильтрованный образец помещали в измерительную ячейку и выдерживали в темноте перед регистрацией в течение 10 мин. Измерения величины Fv/Fm непосредственно в культуре водорослей проводили на флуориметре Aqua-Pen ("Photon Systems Instruments", Чехия).
В опытах использовали препарат наночастиц серебра ("Sigma-Aldrich"). Размер частиц определяли в составе очищенной водной суспензии с помощью динамического рассеяния света на приборе Zetasizer Nano ZS ("Malvern", Великобритания). Для сравнения был использован химический препарат нитрата серебра (AgN03).
Все измерения проводили не менее чем в пяти повторностях. На представленных рисунках приведены результаты опытов, повторяющиеся не менее трех раз.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис. 1 представлена гистограмма размера наночастиц серебра. Размер частиц определялся методом динамического светорассеяния. В 10% водном растворе у основной группы частиц средний размер составил около 80 ± 13 нм.
Проведенные флуоресцентные исследования на культуре C. reinhardtii подтвердили, что фотосинтетический аппарат водорослей является чувствительной мишенью для наночастиц серебра. После суточной инкубации водорослей с нано-частицами серебра в концентрации 2 х 10-6 М активность ФС2 снижалась. В концентрации
2
0
1
Параметры ОЛР-кинетики индукции флуоресценции, измеренной на клетках Clamydomonas reinhardtii после 24 ч инкубации с AgNP в разных концентрациях. Измерения кинетики индукции флуоресценции проводили на приборе М-РЕА2 при освещении действующим светом с интенсивностью 1000 мкЕ/м2 с
Параметры JIP-теста Контроль AgNP 2 х 10—6M AgNP 2 х 10-5 M
Fv /Fm Максимальный квантовый выход разделения зарядов в ФС2 0.71 0.69 0.66
Vj Относительная амплитуда О-Г фазы 0.39 0.41 0.43
Vi Относительная амплитуда 1-1 фазы 0.67 0.68 0.68
Mo Начальный наклон фазы О—Г роста флуоресценции 0.86 0.90 0.93
sm Площадь между кинетической кривой флуоресценции (О-Л-1-Р) и уровнем Гт, нормированная на величину Д 19.11 19.78 20.9
ABS/RC Среднее значение поглощенных потоков фотонов в РЦ ФС2 (или видимый размер активной антенны ФС2) 3.12 3.17 3.29
qE Способность к рН-индуцированному нефотохимическому тушению флуоресценции 0.41 0.40 0.32
qpQ Способность пула хинонов тушить флуоресценцию 0.33 0.32 0.32
2 х 10-5 М AgHЧ вызывали уменьшение величины Ду/¥т с 0.71 до 0.66 (таблица). Было отмечено, что и азотистое серебро вызывало изменение Ду/^т до 0.64 при таких же концентрациях (10-5 М).
Для более детального выяснения влияния AgHЧ на фотосинтетическую активность клеток водорослей на приборе М-РЕА2 измеряли параметры быстрой и замедленной флуоресценции, а также Р700 (рис. 2). Выполнение таких исследований важно не только для понимания первичных механизмов воздействия AgHЧ на работу ФС2 и ФС1 и на процессы энергизации фотосинтетических мембран, но и для возможного использования различных параметров флуоресценции в биомониторинге для выяснения токсикологического действия наночастиц серебра в водных системах.
На рис. 2, представлены кинетические кривые индукции флуоресценции после включения света, нормированные по уровню О. В контрольных клетках форма кривой флуоресценции соответствовала
описанной в литературе [11—15]. В кинетике индукции флуоресценции в ответ на свет высокой интенсивности обычно наблюдается несколько компонент, т.е. O—J—I—P переходы. Начальный уровень О соответствует интенсивности флуоресценции хлорофилла при "открытых" РЦ ФС2 (Fo), когда все QA окислены. Временной интервал достижения этого уровня до 50 мкс. Фаза O—J обусловлена све-тоиндуцированным восстановление
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.