ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 461, № 2, с. 239-241
ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 579.222
ВЛИЯНИЕ НАНОКОМПОЗИТА СЕЛЕНА И АРАБИНОГАЛАКТАНА НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ФИТОПАТОГЕНА С1ау1Ъас1ег michiganensis subsp. sepedonicus
© 2015 г. А. В. Папкина, А. И. Перфильева, М. А. Живетьев, Г. Б. Боровский, И. А. Граскова, М. В. Лесничая, И. В. Клименков, Б. Г. Сухов, академик Б. А. Трофимов
Поступило 11.09.2014 г.
Б01: 10.7868/80869565215030305
Среди фитопатогенных грамположительных бактерий наиболее распространенными и значимыми являются анаэробные споронеобразующие бактерии рода С1ау1Ьае1вг, представляющие собой одиночные или соединенные попарно (а также в короткие цепочки) неподвижные палочки. С1ау1-Ьа^вг michiganensis 8иЪ8р. ъервйотеш (8р1еск. й КоИЬ.) 8кар1 е! БигкИ (С. michiganensis) является возбудителем кольцевой гнили картофеля, в результате развития этой болезни потери урожая составляют 10—45% [1, 2]. На сегодняшний день эффективные методы борьбы с С. michiganensis отсутствуют, а все имеющиеся способы являются профилактическими и сводятся к обеззараживанию тары, инвентаря и посадочного материала [3]. При этом в качестве обеззараживающих веществ используются такие агрессивные агенты, как формалин, перекись водорода, соляная кислота и др. [4].
Поэтому чрезвычайно актуальным является поиск эффективных и безопасных способов оздоровления картофеля от С. michiganensis. В связи с этим перспективным может быть использование в качестве обеззараживающего агента гибридного орга-но-неорганического нанокомпозита потенциально антимикробного элементного селена (НК8е) [5—7], получаемого на основе природного гетеропо-лисахарида арабиногалактана — эффективного стабилизатора наночастиц разной природы [8—10].
В настоящей работе мы исследовали влияние нанокомпозита НК8е с содержанием селена 1.23%, а также его предшественников — арабино-
Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской Академии наук, Иркутск
E-mail: Stasy777_90@mail.ru
Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского Сибирского отделения Российской Академии наук Лимнологический институт Сибирского отделения Российской Академии наук, Иркутск
галактана и оксида селена — на жизнеспособность возбудителя кольцевой гнили C. michiganensis. Все эти субстанции хорошо растворимы в воде и удобны в использовании.
Синтез Se-содержащего нанокомпозита. HKSe синтезировали по разрабатываемой нами методологии получения гибридных ор-гано-неорганических нанокомпозитов на основе полисахаридов [11—13]. К раствору 0.5 г арабиногалактана в 17 мл Н2О при перемешивании добавляли 2.5 мл 0.037 М водного раствора SeO2. По истечении 30 мин к полученной смеси добавляли 2 мл 0.066 М водного раствора NaBH4 и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. Выделение нанокомпозита проводили осаждением реакционной смеси в 4-кратном избытке этилового спирта с последующей многократной промывкой на фильтре тем же растворителем. Выход нанокомпозита — 94%. Найдено (массовые проценты): С, 42.32; Н, 6.08; Se, 1.23.
Таким образом, восстановлением диоксида селена борогидридом натрия в воде в присутствии арабиногалактана в качестве стабилизатора образующихся наночастиц элементного селена, получен водорастворимый нанокомпозит с содержанием селена 1.23%.
Для микроскопического исследо-в а н и я бактериальную суспензию инкубировали с HKSe в течение 2 и 24 ч, далее клетки фиксировали в 2.5% растворе глутарового альдегида в 0.1 М фосфатном буфере (pH 7.4) в течение 1 ч. Затем промывали, фиксировали 2% раствором OsO4 в течение 1 ч и после обезвоживания в ряду возрастающих концентраций этанола высушивали на воздухе. Подготовленные таким образом пробы исследовали с помощью просвечивающего электронного микроскопа LEO 906E ("Carl Zeiss", Германия).
Отсутствие каких-либо рефлексов на рентгеновской дифрактограмме нанокомпозита, а также его красно-оранжевый цвет свидетельствуют о
239
8*
240
ПАПКИНА и др.
Рис. 1. Микрофотографии ПЭМ НК8е (а) и бактерий штамма Ас 1405 С1ау1Ьае1вгmichiganensis 88р. sepedonicus после обработки нанокомпозитом. (б) — бактерии после инкубации с нанокомпозитом в течение 2 ч; (в) — бактерии после инкубации с нанокомпозитом в течение 24 ч.
том, что в данном случае реализуется известная рентгеноаморфная (красная) аллотропная модификация элементного селена. Вместе с тем нано-частицы селена хорошо визуализируются в просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ), имеют форму, близкую к сферической, и достаточно узкое размерное распределение (50—80 нм, средний размер 67 нм, рис. 1а). Очевидно, что на-ночастицы достаточно равномерно распределены в полисахаридной матрице.
Исследование влияния HKSe на жизнеспособность бактерий
C. michiganensis проводили с использованием штамма Ас 1405 из Всероссийской коллекции микроорганизмов (г. Москва). Бактерии выращивали в темноте при 25 °C на скошенной агаризо-ванной среде, содержащей (г/л) в контрольных вариантах: диализат дрожжевого экстракта ("Sigma", США) - 10, глюкозу ("Реахим", Россия) - 15, агар-агар ("Биотехновация", Россия) — 10, СаСО3 — 5 ("Реахим"), pH 7.0 ± 0.2. В экспериментальных культурах бактерии выращивали в физиологическом растворе с добавлением HKSe, арабинога-лактана и оксида селена (71.16% Se). Концентрации перечисленных субстанций нормировали по содержанию селена 0.000625%. К 1 мл раствора HKSe (0.000625% Se) добавляли 100 мл суспензии
бактерий, концентрация — 1.6 • 108 клеток/мл. Спустя 1 ч после обработки производили высев бактериальной суспензии на твердую среду и контролировали количество колониеобразующих единиц (КОЕ, клеток/10 мкл) через 3 сут. При статистической обработке полученных результатов использовали критерий ? Стьюдента. Достоверными считали различия прир < 0.05.
Установлено, что при культивировании бактерий с арабиногалактаном достоверного ингиби-рования их роста не наблюдалось (по сравнению с контролем), что свидетельствует об отсутствии антимикробной активности у этого полисахарида (рис. 2).
В вариантах обработки бактерий диоксидом селена мы обнаружили понижение выживаемости суспензионных клеток С. michiganensis на 23% по сравнению с контролем, что можно объяснить токсичностью селенистой кислоты, образующейся при растворении диоксида селена в воде (рис. 2).
В то же время при культивировании бактерий с НК8е мы наблюдали наиболее значительное подавление роста клеток С. michiganensis: уровень выживаемости составил 58% по сравнению с контролем (рис. 2). Данный эффект предположительно можно объяснить тем, что на обедненной среде, содержащей НК8е с арабиногалактаном,
ВЛИЯНИЕ НАНОКОМПОЗИТА СЕЛЕНА И АРАБИНОГАЛАКТАНА
241
Выживаемость Cms, КОЕ/мл 140 г
120
100
80
60
40
20
К
Рис. 2. Выживаемость (M ± m, п = 4) клеток C. michi-ganensis после 1 ч инкубации НК8е и его предшественниками. Концентрация селена — 0.000625%, титр бактерий — 1.6 • 108 клеток/мл, разведение — 1 : 10-6; К — контроль, 1 — арабиногалактан, 2 — НК8е, 3 — диоксид селена.
бактерии захватывали и утилизировали этот полисахарид, в результате чего находящиеся в макромолекулах арабиногалактана наночастицы селена концентрировались непосредственно на поверхности микробных клеток и за счет этого оказывали повышенное токсическое действие.
Для выявления причин снижения жизнеспособности C. miеhiganensis после обработки НК8е нами проведено исследование взаимодействия этого нанокомпозита и микробных клеток C. miеh-iganensis при помощи ПЭМ (рис. 2). Установлено, что после 2 ч инкубации бактерий с НК8е их морфология не отличалась от контроля (рис. 1б). А после 24 ч инкубации морфология бактериальных клеток значительно изменилась. Клетки стали утолщенными и укороченными (рис. 1в). Вероятно, наблюдаемое изменение формы бактериальной клетки может свидетельствовать о токсическом действии селена, заключенного в наноком-позите.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что НК8е проявляет бактерицидный эффект по отношению к возбудителю кольцевой гнили картофеля C. miеhiganensis. Обнаруженный бактерицидный эффект НК8е выражен сильнее, чем у его предшественников — диоксида селена и арабиногалактана. Результаты визуализации взаимодействия микробных клеток и НК8е могут служить подтверждением губительного действия нанокомпозита на бактериальные клетки.
В экспериментах использовали оборудование Байкальского аналитического центра коллективного пользования ИНЦ СО РАН.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке междисциплинарным интеграционным проектом № 134 СО РАН, проектом № 14— 44-04107 РФФИ_Сибирь, а также интеграционным проектом № 4 совместных исследований СО РАН с Академией наук Монголии и Министерством образования, культуры и науки Монголии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Eichenlaub R, Gartemann K.H. // Annu. Rev. Phyto-pathol. 2011. V. 49. P. 445-464.
2. Попкова К.В., Шнейдер Ю.И., Воловик А.С., Шмыг-ля В.А. Болезни картофеля. М.: Колос, 1980. 304 с.
3. Анисимов Б.В., Белов Г.Л., Варицев Ю.А., Еланский С.Н., Журомский Г.К., Завриев С.К., Зейрук В.Н., Иванюк В.Г., Кузнецова М.А., Пляхневич М.П., Пше-ченков К.А., Симаков Е.А., Склярова Н.П., Сташев-ски З., Усков А.И., Яшина И.М. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков. М.: Картофелевод, 2009. 272 с.
4. Secor G.A., DeBuhr L, Gudmestad N.C. // Plant Disease. 1988. V. 72. № 7. P. 585-588.
5. Tran P., Webster T. // Intern. Nanomed. 2011. № 6. P. 1553-1558.
6. Graskova I.A., Zhivet'yev М.А., Borovskii G.B., SukhovB.G. // J. Stress Physiol. Biochem. 2012. V. 8. № 3. P. S33.
7. Перфильева А.И., Папкина А.В., Боровский Г.Б., Сухов Б.Г., Граскова И.А., Трофимов Б.А. // Изв. вузов Прикл. химия и биотехнология. 2013. Т. 5. № 2. С. 52-56.
8. Трофимов Б.А., Сухов Б.Г., Александрова Г.П., Медведева С.А., Грищенко Л.А., Малькина А.Г., Феоктистова Л.П., Сапожников А.Н., Дубровина В.И., Мартынович Е.Ф., Тирский В.В., Семенов А.Л. // ДАН. 2003. Т. 393. № 5. С. 634-638.
9. Сухов Б.Г., Александрова Г.П., Грищенко Л.А., Феоктистова Л.П., Сапожников А.Н., Пройдакова О.А., Тьков А.В., Медведева С.А., Трофимов Б.А. // ЖСХ. 2007. Т. 48. № 5. С. 979-984.
10. Petrova M.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.