научная статья по теме ВЛИЯНИЕ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ НА БАКТЕРИИ ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТОЙ ПОЧВЫ Сельское и лесное хозяйство

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ НА БАКТЕРИИ ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТОЙ ПОЧВЫ»

ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2010, № 12, с. 1489-1493

УДК 631.46:632.122.2

БИОЛОГИЯ ПОЧВ

ВЛИЯНИЕ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ НА БАКТЕРИИ ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТОЙ ПОЧВЫ*

© 2010 г. А. В. Назаров, Л. Н. Ананьина, О. В. Ястребова, Е. Г. Плотникова

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

Поступила в редакцию 01.07.2009 г.

Изучено влияние нефтяного загрязнения на бактерии дерново-подзолистой почвы, нефть была внесена в почву 8, 11 и 17 лет назад. Установлено, что нефтяное загрязнение оказывает длительное негативное воздействие на численность и биомассу почвенных бактерий. При этом недостаток доступного фосфора является одним из основных негативных факторов, влияющих на биомассу и численность бактерий в условиях "старого" нефтяного загрязнения дерново-подзолистых почв, так как добавление в нефтезагрязненные почвы №2НР04 снимало данный отрицательный эффект. С помощью метода денатурирующего градиентного гель-электрофореза обнаружено влияние нефтяного загрязнения на таксономическое разнообразие и структуру бактериального сообщества исследуемых почв.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время нефть является одним из распространенных загрязнителей почвы. Попадая в почву, она из-за медленной скорости деструкции тяжелых нефтяных фракций оказывает на почвенные биоценозы длительное воздействие, достигающее в случае сильного загрязнения 10—20 и более лет [2, 14]. Важнейшим компонентом почвенных экосистем являются бактерии, деятельностью которых во многом обусловлена способность нефтеза-грязненных почв к самоочищению. Углеводороды нефти оказывают на микроорганизмы токсическое действие, кроме того, нефтяное загрязнение влияет на них через трансформацию физико-химических свойств почвы: уменьшение доступности элементов минерального питания, ухудшение водного и воздушного режимов, изменение реакции почвенной среды и структуры почвы [1, 4, 12]. В результате нефтяного загрязнения изменяется общая численность, биомасса микроорганизмов и структура микробного сообщества почвы [1, 4, 5, 12, 16, 17].

Однако основное количество работ посвящено изучению влияния на почвенные микроорганизмы нефтяных загрязнений с небольшим, не превышающим 3—5 лет сроком. Данные о микробных сообществах почв с более длительными сроками загрязнения нефтью крайне немногочисленны. Известно, что основное действие нефти в почве на микроорганизмы обусловлено наличием в ней легких и тяжелых фракций, из которых первые обладают токсичностью, вторые — ингибирующим эффектом, увеличивая гидрофобность почвы и ухудшая ее водно-воздушный режим [13]. В нефтезагрязненной более 5 лет назад почве остают-

♦Исследования выполнены при финансовой поддержке проекта РФФИ-Урал № 07-04-96016.

ся только сложные малодоступные для микробной деструкции высокомолекулярные нефтяные соединения, относящиеся, главным образом, к битумои-дам. Вследствие этого происходит снижение численности гетеротрофных микроорганизмов по сравнению с предыдущим этапом деградации нефти, при этом доля в них углеводородокисляющих микроорганизмов остается повышенной [10].

Целью данного исследования была оценка воздействия нефти на численность, биомассу бактерий, а также на структуру бактериального сообщества дерново-подзолистой почвы в условиях "старого" загрязнения.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили в лабораторных условиях, основным объектом служила почва с площадок, экспериментально загрязненных нефтью 17, 11 и 8 лет назад в дозе 24 л/м2, находящихся на территории опытного стационара, расположенного в Добрянском р-не Пермской обл. Для загрязнения использовали нефть Ярино-Ка-менноложского месторождения (содержание парафинов — 5.4%, серы — 0.51—0.79%, плотность — 0.816—0.838 г/см3). Почва участка биостанции дерново-подзолистая среднесуглинистая, содержание гумуса — 2.86%, рН водный — 6.3, рН солевой - 5.6, N общ - 0.123%.

Образцы почвы отбирали из поверхностного слоя 0-10 см. До начала анализов почву очищали от растительных остатков, просеивали через сито (диаметр ячеек 2 мм) и инкубировали в течение 14 сут в темноте при температуре 22°С с увлажнением 60% от полной влагоемкости. Для оценки действия на почвенные бактерии недостатка до-

Таблица 1. Физико-химические свойства почв

Показатель Без загрязнения Срок загрязнения, лет

17 11 8

N H+, мг/кг 10.5 17.2 15.3 10.0

N О-, мг/кг 7.6 3.4 2.9 2.0

P2O5, мг/100 г 12.7 5.6 7.6 5.1

K2O, мг/100 г 9.8 9.8 9.9 9.2

Время впитывания 0.01 4.43 9.40 19.15

капли, мин

Количество битумои- 0.05 0.52 0.81 1.70

дов, %

ступных фосфорных соединений были поставлены лабораторные эксперименты с добавлением гидрофосфата натрия Na2HPO4 до концентрации подвижного фосфора в почве без загрязнения (12.7 мг P2O5 на 100 г почвы) и до концентрации подвижного фосфора 26 мг P2O5 на 100 г почвы.

Общую численность бактерий и бактериальную биомассу определяли прямым методом с помощью люминесцентной микроскопии по Коже-вину, Звягинцеву [7]. Количество битумоидов в почвах — гравиметрическим методом после испарения растворителя, экстракция проводилась хлороформом при комнатной температуре до отсутствия люминесценции в экстракте при ультрафиолетовом освещении [6]. Гидрофобные свойства почвы оценивали по скорости впитывания водной капли [13].

Биоразнообразие бактериального сообщества почвы изучали молекулярно-генетическими методами. Для этого из почвы выделяли суммарную ДНК по экспресс-методу [3] с использованием для десорбции бактериальных клеток из почвенных частиц буфера (30 mM трис-HCl; 10 mM ЭД-ТА; 0.1 M NaCl; 1% поливинилполипирролидон; 2% додецилсульфата натрия). С выделенной ДНК проводили полимеразную цепную реакцию гена 16S рРНК с использованием праймеров 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') и 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-) по протоколу [18]. С полученных ампликонов полного гена 16S рРНК амплифицировали фрагмент, составляющий 526 пар нуклеотидов (п.н.), с использованием праймера 27F, включающего 40 п.н. GC-кон-цевой последовательности (5'-CGCCCG-CCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCC GCCCG-3 ) на 5'-конце, и 518R (5'-ATTAC-CGCGGCTGCTGG- 3') [21]. Амплификацию проводили в термоциклере My Cycler (фирма "Bio-Rad Laboratories", США).

Разделение фрагментов гена 16S рРНК было выполнено денатурирующим градиентным гель-

электрофорезом (ДГГЭ) в 6% (в/об) полиакрила-мидном геле, содержащем линейный денатурирующий химический градиент от 35 до 50%, где 100% составляет 7 М мочевина и 40% формамид согласно протоколу [20]. Электрофорез проводили в течение 5 ч при 130 V и температуре 60°С на приборе Dcode™ Universal Mutation System (фирма "Bio-Rad Laboratories", США). Детекцию полос в геле осуществляли, используя алгоритм поиска полос пакета программ Quantity One версия 4.6 (фирма "Bio-Rad Laboratories Laboratories", США). В анализ были включены полосы, имеющие интенсивность выше 0.2% от суммарной интенсивности полос дорожки.

Оценку таксономического разнообразия проводили с использованием индекса Шеннона-Уи-вера (H) и коэффициента выравненности (EH), при этом считали, что количество полос на форе-грамме соответствует числу таксономических групп бактерий в почвенной пробе, а интенсивность свечения полос отражает численность таксона [19]. Для построения дендрограммы был использован невзвешенный парногрупповой метод (UPGMA), а в качестве меры сходства коэффициент Дайса. Расчет коэффициента и построение дендрограммы осуществляли с применением пакета программ Quantity One версия 4.6 (фирма "Bio-Rad Laboratories", США).

Достоверность полученных результатов определяли с помощью критерия Стьюдента, статистическую обработку проводили в программе Microsoft Excel 2002.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Нефтяное загрязнение оказывает длительное влияние на численность и биомассу почвенных бактерий. Численность и биомасса бактерий в почве без загрязнения превышали таковые в неф-тезагрязненных почвах на 12-35 и 35-60% соответственно (рис. 1). В вариантах с нефтяным загрязнением минимальная численность и биомасса бактерий отмечена в почве с наименьшим сроком загрязнения — 8 лет, наибольшая численность бактерий наблюдалась в почвах, загрязненных 11 лет назад, а наибольшая биомасса бактерий — в почве с 17-летним сроком загрязнения.

Негативное действие нефтяного загрязнения на численность и биомассу бактерий обусловлено изменениями агрохимических и физических характеристик исследованных почв. Из них наиболее значительными являются присутствие в почве повышенного количества битумоидов и вследствие этого высокая гидрофобность почвы, а также низкая концентрация подвижного фосфора (табл. 1). Нефтезагрязненные почвы также содержали меньше нитрат-ионов, однако из-за большей концентрации аммония, за исключением

почвы, загрязненной 8 лет назад, количество подвижного азота в почвах при загрязнении нефтью в целом больше, чем в почве без загрязнения.

Внесение №2НР04 в нефтезагрязненные почвы снимало негативное влияние загрязнения на почвенные бактерии. В варианте с добавлением в почвы №2НР04 до концентрации 26 мг Р205/100 г численность и биомасса бактерий в нефтезагрязнен-ных почвах была выше, чем в почве без загрязнения на 20-58%. При этом отмечается повышение бактериальной численности и биомассы с увеличением в почве содержания битумоидов, что указывает на их использование почвенными микроорганизмами в качестве субстрата и на усиление процесса самоочищения при добавлении №2НР04 исследованных загрязненных почв.

Ранее проведенными исследованиями установлено отрицательное действие нефтяного загрязнения почвы на количество в ней подвижных фосфорных, а также обменных калийных соединений, что объясняется иммобилизацией их в биомассе углеводородокисляющих микроорганизмов и обволакиванием нефтью почвенных частиц [1, 12]. Выравнивание различий данных агрохимических показателей нефтезагрязненных и незагрязненных дерново-подзолистых почв происходило через три вегетационных сезона предположительно из-за высвобождения фосфорных и калийных соединений из микробной биомассы [1]. Согласно литературным данным длительное воздействие нефтяного загрязнения на микроорганизмы обусловлено присутствием в почве тяжелых фракций нефти,

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком