АГРОХИМИЯ, 2007, № 4, с. 46-50
УДК 632.4:633.11:546.723
ВЛИЯНИЕ НИТРАТА ЖЕЛЕЗА НА РОСТ И ЗАЩИТНЫЕ РЕАКЦИИ КАЛЛУСОВ ПШЕНИЦЫ ОТ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТВЕРДОЙ ГОЛОВНИ*
© 2007 г. Н. Б. Трошина, Л. Г. Яруллина, О. Б. Сурина, И. В. Максимов
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН 450054 Уфа, просп. Октября, 71, Россия E-mail: phyto@anrb.ru Поступила в редакцию 05.07.2006 г.
Изучали влияние нитрата железа на рост и защитные реакции каллусов пшеницы Triticum aestivum и T. timopheevii к возбудителю твердой головни Tilletia caries. Добавление Fe(NO3)3 в среду культивирования каллусов подавляло их рост, приводило к разрыхлению плотных участков каллусов, раннему прорастанию спор гриба, обильному росту мицелия и подавлению активности оксалатоксида-зы во фракции, связанной с клеточной стенкой. Выявлена связь между активностью оксалатокси-дазы, подавлением роста каллусов и нарушением их структуры.
ВВЕДЕНИЕ
Загрязнение окружающей среды различными токсическими соединениями происходит все возрастающими темпами. Оно влияет не только на здоровье человека, но и на рост и развитие и других организмов, включая растения. Так, даже относительно невысокие концентрации тяжелых металлов в среде вызывают снижение плотности корневых волосков и их коллапс [1]. Их избыток приводит к снижению числа делящихся клеток, вызывает хромосомные аберрации, оказывает отрицательное влияние на биохимический статус растений, вызывая денатурацию ферментов или маскируя их каталитически активные группы [2-4]. Соответственно, токсические соединения должны приводить к снижению устойчивости растений к негативным факторам среды, например к фито-патогенам. Так, нитрат железа приводит к снижению активности оксалатоксидазы [5], защитные свойства которой связаны с ее участием в генерации активных форм кислорода (АФК) [6]. Известно, что в высоких концентрациях АФК токсичны для фитопатогенов [7, 8]. Кроме того, одна из форм АФК - пероксид водорода является необходимым для образования укрепляющего клеточные стенки растений лигнина [9] и вторичным мессенджером, запускающим каскад защитных реакций растений [10].
Совместные каллусные культуры с возбудителями грибных болезней могут быть использованы как модель для изучения механизмов защитного ответа клеток растений на действие фитопатоген-ных грибов, так как считается, что клеточные механизмы устойчивости in vivo и in vitro являются
* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект < 05-04-48310) и гранта Президента РФ МД-1651.2005.4.
идентичными [11]. В нашей лаборатории механизмы устойчивости клеток растений исследуются на совместных культурах каллусов пшеницы с возбудителем твердой головни. Одним из ключевых моментов взаимоотношения гриба с каллусом пшеницы является его исключительное распространение по межклетникам рыхло расположенных паренхимных клеток [12].
В литературе практически отсутствуют сведения о влиянии ингибиторов активности ферментов, регулирующих уровень Н2О2, на ростовые характеристики растений и их ответные реакции на инфицирование фитопатогенными грибами. Поскольку нитрат железа является одним из ингибиторов генерации пероксида водорода, такие данные можно получить с использованием совместных культур каллусов пшеницы с возбудителем твердой головни.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве эксплантов для получения каллу-сной ткани использовали незрелые зародыши пшеницы Triticum aestivum L. сорта Жница и T. timopheevii Zhuk. (каталог ВИР К-58666), культивируемые на питательной среде Мурасиге и Скуга (МС). Ранее нами было показано, что каллусы T. timopheevii характеризуются высокой устойчивостью к возбудителю твердой головни Tilletia caries (DC.) Tul. в сравнении с каллусами T. aestivum [13].
Часть каллусов пересаживали на среду МС, содержащую 0.4 и 0.04 мМ Fe(NO3)3. О росте каллусов судили по их сырой и сухой массе. Половину каллусов инфицировали телиоспорами T. caries. Морфологические характеристики каллусов и их совместных культур с возбудителем твердой головни (наличие уплотненных участков и ризои-
Рис. 1. Влияние Fe(NO3)3 в различных концентрациях на морфологию и устойчивость каллусов T. aestivum (1) и T. ti-mopheevii (2) к T. caries (20 сут после инокуляции): а, б - на среде МС (контроль); в-е - на среде МС + Fe(NO3)3 в концентрациях 0.04 мМ (в, г) и 0.4 мМ (д, е). а, в, д - неинфицированные каллусы, б, г, е - инфицированные каллусы. ПУ - плотные участки, СУ - сухие участки
дов, скорость прорастания спор, площадь поверхности каллусов, покрытая мицелием гриба) оценивали на протяжении 20 сут после инокуляции. На срезах каллусов изучали размеры клеток. Препараты окрашивали метиленовым синим. Кроме того, через 20 сут после инокуляции в каллусах анализировали активность оксалатоксида-зы микрометодом [14].
В качестве контроля использовали неинфицированные и инфицированные каллусы, растущие на среде МС без добавления Fe(NO3)3. Опыты проводили в 3-х повторностях, в каждом варианте фиксировали по 5-10 каллусов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Введение нитрата железа в среду культивирования каллусов пшеницы изменяло их рост и морфологию. Контрольные каллусы Т. aestivum на протяжении опыта были рыхлыми, крупно глобулярными, с небольшим числом плотных участков (рис. 1а). Введение в среду культивирования каллусов нитрата железа в концентрации 0.04 мМ через 7 сут от пассажа приводило к подсыханию наружных участков глобул. В конце наблюдений уплотненные участки на каллусах не обнаруживались, каллусы становились оводненными и более рыхлыми (рис. 1в). Под влиянием нитрата железа в концентрации 0.4 мМ подсыхание наружных участков каллусов регистрировали уже через 5 сут, а к концу опыта наблюдали высокую овод-ненность каллусов и отсутствие на них плотных участков (рис. 1д). Об оводненности каллусов можно было судить и по ускоренному накоплению их сырой массы на фоне замедленного нарастания сухой массы (рис. 2).
В контроле каллусы Т. timopheevii были мелкоглобулярными (рис. 1а), мягкими, с уплотненной серединой глобул. Добавление в среду культивирования каллусов нитрата железа в концентрациях 0.04 и 0.4 мМ через 7 сут от пассажа вызывало подсыхание наружных участков глобул, так же как это отмечено у каллусов Т. aestivum, а к концу опыта - появление крупных глобул рыхлой консистенции. Эти изменения были более выражены в варианте с Fe(NO3)3 в концентрации 0.4 мМ (рис. 1д). В этом варианте опыта к концу наблюдений каллусы Т. timopheevii становились оводненными, на них образовывались единичные ризоиды (рис. 1д). Исчезновение плотных участков с одновременным увеличением площади рыхлых участков и появлением ризоидов отмечено при длительном культивировании морфогенного каллуса гречихи на среде, содержащей колхицин [15].
Fe(NO3)3 в использованных концентрациях вызывал изменения структуры плотных участков каллусов. В контрольных каллусах обоих видов пшеницы центральная часть глобул состояла из меристематических клеток с прилежащими к ним плотно расположенными паренхимными клетками (рис. 3а, 3в). Остальные паренхимные клетки были расположены рыхло. Спустя 5 сут от начала культивирования каллусов Т. aestivum на среде с Fe(NO3)3 они увеличивались в размерах (рис. 36). Сходные изменения в каллусах Т. timopheevii выявлялись только к концу опыта и только при их росте на среде с нитратом железа в высокой концентрации (рис. 3г).
Таким образом, культивирование каллусов пшеницы на среде с нитратом железа приводило к замедлению их роста, разрыхлению плотных участков каллусов и, соответственно, увеличению
§
о се £ , JS jM
Я о & к 3 и о о
Н
° ы о s & н
н о &
С
280 260
g 240 S2 220
о о л л
£ £ « «
о о * к ?у и ° о н а о н & н
Н о &
С
□ i □ 2
200 180 160 140 120 100 140 135 130 125 120b i—i 115 110 105 100
Рис. 2. Влияние Fe(NOз)з на прирост сухой и сырой массы каллусов пшеницы (23 сут культивирования на среде МС + Fe(NOз)з): а - Т. aestivum, б - Т. timopheevii. 1 - среда МС (контроль); 2 - среда МС + 0.04 мМ Fe(NO3)3; 3 - среда МС + 0.4 мМ Fe(NO3)3.
площади рыхлых участков и ризогенезу. Нарушения в росте и структуре каллусов происходили раньше и были более заметны у каллусов T. aesti-vum при высокой концентрации нитрата железа.
На контрольных каллусах T. aestivum споры гриба начинали прорастать через 6 сут после инокуляции. При концентрациях Fe(NO3)3 0.04 и 0.4 мМ это происходило через 5 сут. На каллусах T. ti-mopheevii прорастание спор наблюдали через 14, 13 и 12 сут соответственно. Кроме того, при концентрации Fe(NO3)3 0.04 мМ к концу наблюдений мицелий покрывал б0льшую, чем в контроле, площадь поверхности каллусов обоих видов пшеницы (рис. 1г), то есть рос быстрее, чем в контроле. Следует при этом отметить, что повышение концентрации Fe(NO3)3 до 0.4 мМ способствовало подавлению роста мицелия гриба (рис. 1е).
Инфицирование каллусов мягкой пшеницы T. aestivum инициировало у них ризогенез (рис. 16), что, по-видимому, было обусловлено способностью гриба T. caries продуцировать ауксины [16]. Воздействие нитрата железа в концентрации 0.04 мМ на совместные культуры T. aestivum и T. caries вызывало более сильный ризогенез в сравнении с контрольными культурами (рис. 1г). Следует заметить, что если в контроле инфицирование каллусов T. timopheevii, как правило, не инициировало ризогенез (рис. 16), то в присутствии
Ре(К03)3 в изученных концентрациях происходила инициация ризогенеза (рис. 1г).
Таким образом, культивирование каллусов пшеницы на среде с нитратом железа ослабляло их устойчивость к возбудителю твердой головни, особенно у каллусов Т. aestivum. Этому могло способствовать разрушение плотных участков и увеличение площади поражаемых грибом рыхлых участков каллусов.
Предполагается, что важную роль в модификации клеточной стенки, а также формировании межклеточных взаимоотношений играет оксала-токсидаза и сопряженное с ее активацией образование пероксида водорода [17].
Особый интерес представляет и защитная роль этого фермента в растениях ячменя [18] и пшеницы [19], инфицированных фитопатогенами. Возможно, что наблюдаемые нарушения структуры и подавление защитных реакций каллусов при их росте
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.