БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2010, том 27, № 6, с. 482-488
УДК 577.1;577.115.3
ВЛИЯНИЕ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР НА ЖИРНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ КОНТРАСТНЫХ ПО ХОЛОДОУСТОЙЧИВОСТИ ВИДОВ ЗЛАКОВ
© 2010 г. С. П. Макаренко*, Л. В. Дударева, А. И. Катышев, Т. А. Коненкина, А. В. Назарова, Е. Г. Рудиковская, Н. А. Соколова, В. В. Черникова, Ю. М. Константинов
Учреждение Российской академии наук Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук, Иркутск, 664033, ул. Лермонтова, 132; тел.: (3952)42-67-21; факс: (3952)51- 07-54; электронная почта: matmod@sifibr.irk.ru; *makar@sifibr.irk.ru
Поступила в редакцию 27.02.2010 г. После доработки 12.04.2010 г.
Изучен жирнокислотный состав липидов проростков и корней злаков контрастных по холодоустойчивости растений при двух температурах роста: 27 и 4°С. Биосинтез жирных кислот (ЖК) в липидах проростков холодочувствительного злака кукурузы (Zea mays L.) при обеих температурах контролировался хлоропластной ю6-десатуразой, а в липидах корней — микросомальной ю6-десатуразой. При низкой температуре содержание линолевой кислоты в колеоптилях проростков кукурузы составляло 56.2 против 43.3% в контроле и 52.2 против 38.5% — в корнях. Содержание а-линоленовой кислоты при этом составляло 6.7—6.8% и увеличивалось в липидах корней с 3.1 до 4.7%. Биосинтез ЖК липидов в колеоптилях проростков пшеницы (Triticum aestivum L.) и пырейника сибирского (Elymus sibiricus L.) при низкой температуре контролировался хлоропластной ю3-десатуразой, которая вызывала небольшое увеличение содержания а-линоленовой кислоты — с 29.7 до 30.2% в пшенице и с 22.8 до 25.8% в пырейнике. В тканях корней этих злаков биосинтез а-линоленовой кислоты контролировался микросомальной ю3-десатуразой: содержание а-линоленовой кислоты увеличивалось с 6.1 до 17.1% в пшенице и с 7.1 до 12.0% в пырейнике сибирском.
Ключевые слова: Elymus sibiricus, Triticum aestivum, Zea mays, жирные кислоты, ацил-липидные деса-туразы.
Низкая температура — один из основных факторов стресса, которому подвергаются растения. Многие виды растений способны адаптироваться к низким температурам окружающей среды в течение длительного периода и обладают комплексом биохимических и физиологических реакций, лежащих в основе акклиматизации к воздействию низких температур. Типы и способы адаптации растения к низким температурам изучают на разных уровнях структурной организации [1—3]. Так, важную роль в процессах адаптации играют липи-ды, образующие в мембранах растений липидный бислой, содержащий различные ферменты, в том числе ацил-липидные десатуразы, катализирующие синтез ненасыщенных жирных кислот (ЖК): ацил-[ацил-переносящий белок]-десатуразу ((ацил-АПБ)-десатураза), связанную с АПБ-16 : 0 и АПБ-18 : 0, и ацил-липидные десатуразы, различающиеся по структуре и свойствам [4—6]. В мембранах пластид растений растворимые ацил-АПБ-десатура-зы образуют первую двойную связь в цепях ЖК. Продукт реакции — олеиновая кислота, связанная с АПБ, может транспортироваться как в мембраны хлоропластов, так и в эндоплазматический ретикулум (ЕЯ) для последующей десатурации с образованием ЖК 18 : 2 и 18 : 3 [7, 8]. В цитоплаз-
матических мембранах высших растений синтез полиненасыщенных ЖК (ПНЖК) катализируется мембранными ацил-липидными ®6-(FAD2) и ®3-(FAD3) десатуразами [3, 4, 9—11]. В мембранах хлоропластов синтез ПНЖК осуществляют нерастворимые мембранные ацил-липидные ю6-(FAD6) и ®3-(FAD7, FAD8) десатуразы [8, 12-15]. В устойчивости растений к воздействию низких температур ключевая роль отводится хлоропласт-ным и микросомальным ю6- и ю3-десатуразам, катализирующим образование второй и третьей двойной связи в ЖК мембранных липидов [2]. В геноме Arabidopsis thaliana идентифицировано пять генов ю6- и ю3-десатураз: fad2 и fad6 (кодируют микросомальную и хлоропластную ю6-деса-туразы соответственно), fad3 (микросомальная ю3-десатураза), а также два паралогичных гена fad7 и fad8 хлоропластной ю3-десатуразы [9, 16, 17]. Роль отдельных генов fad в формировании холодоустойчивости у разных видов растений может существенно различаться. С использованием мутантных линий арабидопсиса показана важная роль гена fad2 в синтезе ПНЖК и устойчивости растений данного вида к действию низких положительных температур [16]. Из генов fad3, fad7 и fad8, кодирующих ю3-десатуразы арабидопсиса,
усиление экспрессии в условиях холодового стресса характерно только для гена fad8 [13, 19]. Показана органоспецифичность экспрессии двух генов fad2 сои [8]. Важно отметить, что хотя содержание транскриптов этих генов при низкотемпературном воздействии не увеличивалось, однако уровень ПНЖК в семенах сои возрастал [10]. По всей вероятности, этот факт можно объяснить регуляцией экспрессии гена fad2-1 на посттрансляционном уровне [20]. В условиях холодового стресса экспрессия генов кукурузы, кодирующих хлоропластные FAD, изменялась разнонаправленно: содержание транскриптов гена fad7 снижалось, а fad8 возрастало [21]. В работе [14] показано, что важную роль в адаптации растений пшеницы к действию низких температур играет повышение на транскрипционном и посттранс -ляционном уровне экспрессии гена микросо-мальной ю3-десатуразы (FAD3) в корнях. В то же время у другого злака — риса (Oryza sativa L.) — в сходных условиях экспрессия генаfad3 снижалась [22]. Температурозависимые изменения ЖК-со-става липидов — явление весьма распространенное. В организмах, продуцирующих ПНЖК, наблюдаются обратные соотношения между температурой роста и накоплением ПНЖК в составе мембранных липидов [3]. Температурные флуктуации, вызывающие изменения в составе ПНЖК клеточных мембран, определяют также уровень мембранной текучести и, таким образом, участвуют в процессе выживания клетки в широком диапазоне температур. В настоящей работе методами газожидкостной хроматографии изучен ЖК-со-став липидов мембран у таких существенно различающихся по способности к холодовой адаптации видов злаков, как холодоустойчивые яровая пшеница (Triticum аestivum) и многолетний дикорастущий пырейник сибирский (Elymus sibiricus), а также холодочувствительная кукуруза (Zea mays).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили корни и ко-леоптили этиолированных проростков кукурузы (Z. mays L.), пшеницы (T. aestivum L.) и пырейника сибирского (E. sibiricus L.). Семена проращивали на влажной фильтровальной бумаге в воздушном термостате при 27°С. В экспериментах по хо-лодовой обработке 5-суточные проростки выдерживали до 10 сут при пониженной (4°С) температуре. Образцы для анализа ЖК-состава отбирали на 5-й день культивирования и на 5-й день холодовой обработки. Экстракцию липидов из тканей исследуемых объектов проводили с использованием делительной воронки (V = 20 мл) с применением системы растворителей хлороформ-метанол-вода (2 : 1 : 0.8 v/v/v) [23]. Хлороформ из липидного экстракта удаляли под вакуу-
мом с помощью роторного испарителя RVO-64 (Чехия). Метиловые эфиры ЖК получали по методу [24]. К экстракту липидов после удаления растворителя добавляли 1% метанольный раствор H2SO4 и нагревали на водяной бане при 60°С в течение 30 мин. После охлаждения к полученной смеси добавляли воду (до 1/2 объема смеси) и трижды экстрагировали метиловые эфиры ЖК гексаном. Дополнительную очистку метиловых эфиров ЖК проводили с помощью тонкослойной хроматографии на стеклянных пластинках с си-ликагелем КСК (Россия) в камере с бензолом. Метиловые эфиры ЖК анализировали методом газожидкостной хроматографии с использованием хромато-масс-спектрометра 5973N/6890N MSD/DS Agilent Technologies (США). Детектор -масс-спектрометр — квадруполь, способ ионизации — электронный удар (EI), энергия ионизации 70 эВ. Для анализа использовали режим регистрации полного ионного тока, для разделения — капиллярную колонку HP-INNOWAX (30 м х х 250 мкм х 0.50 мкм). Неподвижная фаза — поли-этиленгликоль. Подвижная фаза: гелий, скорость потока газа 1 мл/мин. Температура испарителя 250°С, источника ионов 230°С, детектора 150°С, температура линии, соединяющей хроматограф с масс-спектрометром, 280°С. Диапазон сканирования 41—450 а.е.м. Объем вводимой пробы — 1 мкл, разделение потоков 5 : 1. Хроматографию проводили в изократическом режиме при 200°С. Метиловые эфиры ЖК идентифицировали с помощью расчета эквивалентной длины алифатической цепи (ECL) [25]. Кроме этого использовали библиотеки масс-спектров NIST 05, а также сравнение времени удерживания со стандартными соединениями. Относительное содержание ЖК оценивали в весовых процентах от общего их содержания в образце. Для оценки ненасыщенности ЖК в липидах злаков использовали индекс ненасыщенности: ИН = XfJ/100, где PJ содержание (вес.%) ненасыщенных ЖК, умноженное на число двойных связей в каждой кислоте [25]. Эффективную активность ацил-липидных ю6- и ю3-мембранных десатураз, участвующих в биосинтезе линолевой и а-линоленовой кислот, определяли из процентного содержания олеиновой, лино-левой и а-линоленовой кислот как олеоил-деса-туразное (ODR) и линолеоил—десатуразное (LDR) отношения (уравнения (1), (2)) [26]:
ODR = (%C18 : 2 + %C18 : 3)/(%C18 : 1 + + %C18 : 2 + %C18 : 3),
LDR = (%C18 : 3)/(%C18 : 2 + %C18 : 3). (2)
В таблицах представлены средние данные из трех—шести биологических повторностей и их стандартные отклонения. Достоверность различий сравниваемых средних значений оценивали с помощью i-критерия (P < 0.05).
Таблица 1. ЖК-состав липидов колеоптилей и корней этиолированных проростков кукурузы, выращенных при контрольной (27°С) и низкой положительной (4°С) температуре
Жирные кислоты Колеоптили, вес.% Корни, вес.%
27°С 4 °С 27 °С 4 °С
С12 0 0.2 ± 0.0 0.1 ± 0.0 0.3 ± 0.1 0.1 ± 0.0
С14 0 0.7 ± 0.1 0.2 ± 0.0 0.6 ± 0.1 0.4 ± 0.1
С15 0 0.3 ± 0.1 0.3 ± 0.1 0.6 ± 0.0 0.4 ± 0.1
С16 0 28.6 ± 2.1 23.4 ± 0.5 31.9 ± 0.7 28.1 ± 1.8
С16 1ю9 0.9 ± 0.3 0.2 ± 0.1 0.4 ± 0.0 0.3 ± 0.1
С16 1ю7 0.2 ± 0.0 0.1 ± 0.0 0.2 ± 0.0 0.6 ± 0.2
C17 0-i 0.2 ± 0.1 0.1 ± 0.0 0.2 ± 0.02 0.2 ± 0.0
C17 0 0.4 ± 0.0 0.2 ± 0.0 0.6 ± 0.0 0.4 ± 0.2
C18 0 3.8 ± 0.3 1.9 ± 0.2 5.7 ± 0.5 2.1 ± 0.2
С18 1ю9 7.5 ± 1.0 3.9 ± 0.5 6.6 ± 0.9
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.