УДК 577.1
ВЛИЯНИЕ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ ГЕЛИЙ-НЕОНОВОГО ЛАЗЕРА НА ЖИРНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ КАЛЛУСНЫХ ТКАНЕЙ
ПШЕНИЦЫ (Triticum aestivum L.)
© 2014 г. Л. В. Дударева*, Е. Г. Рудиковская, В. Н. Шмаков
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132;
*электронная почта: laser@sifibr.irk.ru Поступила в редакцию 16.04.2014 г.
Изучали динамику изменений в содержании жирных кислот общих липидов в каллусах пшеницы (ТгШсит aestivum Ь.) под влиянием низкоинтенсивного излучения гелий-неонового лазера. Установлены существенные различия в жирнокислотном составе липидов в опытных и контрольных каллусах на начальном этапе ответа тканей на воздействие: через 5 мин в облученных тканях существенно увеличивалось содержание насыщенных жирных кислот, снижался индекс ненасыщенности. Через 24 ч индекс ненасыщенности, напротив, был выше в облученных образцах. Через 5 мин после облучения наблюдалось значительное изменение активности Д-9 десатуразы, повышение содержания жирных кислот с длиной углеродной цепи более 18 атомов — суммарное относительное содержание кислот С20—С22 более чем в 2 раза превышало значение в контрольных тканях. Показано, что ответ ткани каллусов пшеницы на действие низкоинтенсивного лазерного излучения сходен с ответом на стрессор. Полученные данные позволяют предположить, что липиды являются одной из ключевых структур, участвующих в ответе растительной ткани на низкоинтенсивное лазерное излучение. Обсуждается роль этого излучения как индуктора стрессовой реакции у растений.
Ключевые слова: ТгШсит aestivum, каллусы, лазер, липиды, длинноцепочечные жирные кислоты, Д-9 десатураза.
Б01: 10.7868/80233475514050041
ВВЕДЕНИЕ
Действие лазерного излучения на живые организмы, в том числе на растения, вызывает интерес практически с момента изобретения лазера. Однако и до настоящего времени нет единой теории, объясняющей все эффекты, возникающие при действии света лазера на биологические объекты. Это связано с относительной сложностью биологических систем и трудностями анализа закономерностей преобразования энергии в живых тканях. Особый интерес представляет действие на биологические объекты лазерного излучения низких интенсивностей, которое, как правило, не носит повреждающего характера. Напротив, считается, что такое излучение стимулирует многие физиологические процессы как в организме человека и животных, так и у растений. При этом механизмы терапевтического действия низкоинтенсивного лазерного излучения и его действия на клетки животных исследуются достаточно интенсивно [1, 2]. Определены первичные фотохимические реакции, лежащие в основе терапевтического действия лазерного излучения [3, 4], и ключевые структуры в клетках и клеточных орга-
неллах, в которых может формироваться ответ на действие лазерного излучения. Показано, что первичной мишенью для лазерного излучения в клетках животных и микроорганизмов являются компоненты окислительно-восстановительных цепей митохондрий, в частности, цитохром-с-ок-сидаза [1]. Сведения же о возможных путях реализации стимулирующего действия низкоинтенсивного лазерного излучения на растительные объекты весьма ограничены [2, 5]. Открытым остается вопрос о ключевых соединениях, участвующих в формировании ответа растительной ткани на низкоинтенсивное лазерное излучение. Между тем физиологический статус растения во многом зависит от интенсивности света, его спектрального состава, дозы излучения и периодичности освещения. Поэтому изучение биологического действия низкоинтенсивного лазерного излучения на растения может представлять интерес не только для выявления оптимальных условий его применения в практических целях, но и для изучения фундаментальных закономерностей действия света на растительные организмы.
Опубликованные и полученные нами данные свидетельствуют о том, что низкоинтенсивное лазерное излучение с длиной волны 632.8 нм может влиять на различные физиологические процессы, в том числе и на те, между которыми отсутствует выраженная взаимосвязь [6]. Следовательно, в реализации биологического действия лазерного излучения, по-видимому, участвует неспецифический, общий для многих процессов механизм. Логично предположить, что именно стресс, как неспецифический системный ответ, может быть одним из путей действия низкоинтенсивного излучения на растительные ткани. К настоящему времени определены основные признаки неспецифической составляющей стресса у растений [7]. Известно, что одним из первичных неспецифических ответов на действие многих факторов, в том числе и стрессовых, является генерация активных форм кислорода (АФК) и усиление процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [4, 8, 9]. Поглощение квантов света может инициировать как процессы ПОЛ, так и изменения кон-формации мембранных белков, состава аминокислот и структуры липидов.
Полученные нами данные [10—13] о влиянии низкоинтенсивного лазерного излучения на ре-докс-статус растительной ткани, фазность ответа, активность гидролитических ферментов и содержание "стрессовых" аминокислот позволили предположить, что таким неспецифическим механизмом может быть стрессовый ответ.
Считается, что суть неспецифических реакций организма на воздействие стрессоров в значительной степени сводится к тем изменениям, которые обнаруживаются в мембранных структурах, в том числе в их липидной составляющей. По состоянию мембран (увеличение проницаемости, ПОЛ, изменение индекса ненасыщенности, качественные и количественные изменения в составе липидов и т.д.) можно с определенной степенью точности диагностировать состояние растения, подвергнутого давлению неблагоприятных факторов.
Известно, что именно жирные кислоты относятся к самым быстро обновляемым компонентам липидов. Под действием стрессора может сдвигаться соотношение различных групп жирных кислот, изменяться степень их ненасыщенности, что, как известно, играет важную роль в формировании защитной реакции клетки в ответ на действие различных факторов [14]. Помимо этого возможно изменение длины цепей жирных кислот, позиционного расположения двойных связей, количества полярных групп [15]. Эти показатели варьируют в широких пределах при изменении температуры, интенсивности освещения, концентрации осмотических веществ и солей [16].
Мы сочли вероятным, что изменения жирно-кислотного состава липидов каллусов пшеницы, вызванные светом лазера, могут быть еще одним доказательством способности лазерного излучения низкой интенсивности вызывать в растительных объектах реакцию, сходную со стрессовой. Поэтому целью представляемой работы был сравнительный анализ изменений химического состава и относительного содержания жирных кислот общих липидов каллусов пшеницы при действии низкоинтенсивного лазерного излучения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для облучения использовали He-Ne лазер, длина волны излучения 632.8 нм в дозе 1.5 Дж/см2 (время облучения 5 мин). Ранее было установлено, что эта доза стимулирует каллусогенез и морфо-генетические процессы в растительной ткани [17]. Объектом исследования служили каллусы пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Скала. В качестве эксплантата использовали зрелые зародыши с половинкой эндосперма. Каллусогенез индуцировали на модифицированной среде Му-расиге-Скуга (MS) с добавлением 2% сахарозы и 2 мг 2,4-Д. Содержание жирных кислот анализировали на протяжении 60 мин после облучения (0, 5, 15, 30, 60 мин) и через 1 сут после воздействия. Навеску растительного материала с целью уменьшения возможных автолитических изменений фиксировали в жидком азоте и растирали до получения гомогенной массы для экстракции липидов. При работе использовали охлажденную лабораторную посуду и реактивы. Липиды экстрагировали смесью хлороформ : метанол : вода в соотношении (2:1: 0.8 v/v/v) [18], содержащей 0.001% антиоксидант (ионол) для предотвращения автоокисления. Для анализа суммарных ли-пидов отделяли хлороформную фракцию. Для контроля выхода липидов использовали нонаде-кановую кислоту (С19:0). Метиловые эфиры жирных кислот получали по методу [19]. Дополнительную очистку метиловых эфиров жирных кислот проводили методом ТСХ на стеклянных пластинках с силикагелем КСК (Россия) в камере с бензолом. Разделение липидов на фракции нейтральных, глико- и фосфолипидов проводили методом колоночной хроматографии [20]. Содержание метиловых эфиров жирных кислот в образцах и содержание липидов в каждой фракции определяли взвешиванием с помощью электронных весов GR-120 (A&N Company Ltd., Япония).
Анализ метиловых эфиров жирных кислот проводили методом газожидкостной хроматографии с использованием хромато-масс-спектро-метра 5973/6890N MSD/DS Agilent Technologies (США). Детектор — масс-спектрометр — квадру-поль, способ ионизации — электронный удар (EI), энергия ионизации 70 эВ, для анализа ис-
пользовали режим регистрации полного ионного тока (SCAN). Для разделения использовали капиллярную колонку HP-INNOWAX (30 м х 250 мкм х х 0.50 мкм). Неподвижная фаза — полиэтилен-гликоль. Подвижная фаза — гелий, скорость потока газа 1 мл/мин. Температура испарителя 250°С, источника ионов 230°С, детектора 150°С, температура линии, соединяющей хроматограф с масс-спектрометром, 280°С. Диапазон сканирования 41—450 а. е. м. Объем вводимой пробы — 1 мкл, разделение потоков 5 : 1. Хроматографиро-вание выполняли в изократическом режиме при 200°С. Идентификацию метиловых эфиров жирных кислот проводили с помощью расчета эквивалентной длины алифатической цепи (ECL) [21]. Кроме того, использовали библиотеки масс-спектров NIST 08, Christie, а также сравнение времени удерживания определяемых кислот со временами удерживания стандартных соединений. Относительное содержание жирных кислот определяли методом внутренней нормализации — в весовых процентах от общего их содержания в исследуемом образце. Для оценки степени ненасыщенности жирных кислот в составе мембранных липидов использовали индекс ненасыщенности (ИН) [22], который рассчитывали по формуле:
ИН = ^ Pjnj IЮ0, (1)
где Pj — содержание жирных кислот (вес. %) и ц — число двойных связей в каждой кислоте. Индекс десатурации (ИД), велич
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.