ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2008, том 55, № 4, с. 523-528
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ ОБРАБОТКИ ЛИСТЬЕВ ПШЕНИЦЫ ДОНОРОМ ОКИСИ АЗОТА НА АНТИОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ ПРИ СТРЕССЕ, ВЫЗВАННОМ АЛЮМИНИЕМ
© 2008 г. X. Чжан*, Я. X. Ли*, Л. Ю. Ху*, С. X. Ван**, Ф. К. Чжан***, К. Д. Ху*
* Школа биотехнологии и пищевой инженерии, Хефейский технологический университет, Хефей, Китай ** Колледж естественных наук, Аньхойский университет науки и технологии, Бенгбу, Китай *** Кафедра биологии, университет Хекси, Чжанги, Китай Поступила в редакцию 16.02.2007 г.
Содержание хлорофилла в проростках пшеницы (Triticum aestivum L.) драматически снижалось при усилении алюминиевого стресса: при 0.2 мМ AlCl3 его содержание уменьшалось вдвое. Это падение уровня хлорофилла можно было смягчить обработкой проростков донором окиси азота, нитро-пруссидом натрия (НПН), и его эффект зависел от концентрации. Обработка проростков НПН сильно стимулировала активности супероксиддисмутазы, каталазы, аскорбатпероксидазы и приводила к накоплению пролина. Эта обработка снижала содержание перекиси водорода и малонового диальдегида и поддерживала постоянный уровень растворимого белка.
Ключевые слова: Triticum aestivum - алюминиевый стресс - ферменты анитиоксидантной защиты - хлорофилл - окись азота.
ВВЕДЕНИЕ
Алюминий является широко распространенным элементом, составляя до 7% всех элементов земной коры [1]. Почва более половины освоенных земель в мире является кислой [2]. При под-кислении почвы в результате антропогенного влияния А1 растворяется и образует токсичный анион (А13+), приносящий вред растениям и вызывающий сильные физиологические нарушения даже при его микромолярных концентрациях в почве [3]. Например, даже при краткосрочной обработке корней кукурузы А1 в их кончиках менялось число и расположение делящихся клеток [4]. Становится очевидным, что долгосрочное влияние А1 на растения определяется, главным образом, благодаря окислительному стрессу [5]. Токсичные концентрации А1 активируют гены AtPox (пероксидазы Arabidopsis) и AtGST (глютатион-8-трансферазы), что указывает на возникновение окислительного стресса [6]. Образование активных форм кислорода (АФК) при окислительном стрессе может приводить к серьезным нарушениям клеточного метаболизма: перекисному окис-
Сокращения: АПО - аскорбатпероксидаза; АФК - активные формы кислорода; КАТ - каталаза; МДА - малоновый диальдегид; НПН - нитропруссид натрия; СОД - су-пероксиддисмутаза.
Адрес для корреспонденции: H. Zhang. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei, 230009 China. Fax: 86-551-2901507; e-mail: zhandzhy@yahoo.com.cn
лению липидов, утечке ионов, деградации белков и даже к некрозам [7]. И хотя растения выработали несколько "стратегий" противостояния окислительному стрессу, вызываемому Al, таким как накопление антиоксидантов [8] и выделение органических кислот [1], но все же они могут только частично смягчать токсичность высоких доз Al. Поэтому повышение устойчивости растений к токсичности Al является важной задачей исследований.
Окись азота - важная сигнальная молекула растений, принимающая участие в регуляции метаболизма АФК [9], экспрессии генов [10], программируемой смерти клеток [11], созревания и старения [12]. NO очень важна для защиты растений от различных абиотических стрессов. Мито-хондриальный фермент Arabidopsis, NO синтаза 1, может снижать содержание АФК и смягчать окислительный стресс [13]. Обработка листьев риса NO защищала растения от окислительного стресса, вызванного паракватом, активируя ферменты антиоксидантной защиты [14]. Было показано, что NO может заметно активировать ката-лазу (КАТ) и аскорбатпероксидазу (АПО) и приводить к накоплению пролина при прорастании семян пшеницы в условиях осмотического стресса [15]. Позже было показано, что NO снижает токсичность Al, предотвращая окислительный стресс в корнях Cassia tora [16].
Вышеперечисленные сообщения показывают, что NO вовлечен в ответную реакцию растений
524
ЧЖАН и др.
2.5
ей
4
§ ^2.0
f«
& я
° 2 1 5
<D &
5 ^1.0
i§
0.5
о
О
0
0.1 0.2 0.4 0.1
Концентрация Al, мМ
1.0
Рис. 1. Подавление алюминием содержания хлорофилла в листьях проростков пшеницы, выращенных на растворе Хогланда, содержавшем разные концентрации AlClз, в течение 8 дней.
на окислительный стресс. Однако неизвестно, участвует ли NO в противостоянии Al стрессу и если участвует, то каким образом. В связи с этим мы исследовали возможное защитное влияние NO на проростки пшеницы, подвергнутые действию Al: мы измеряли содержание хлорофилла, H2O2, пролина, растворимых белков, малонового диальдегида (МДА) и активность ферментов ан-тиоксидантной защиты.
МЕТОДИКА
Семена пшеницы (Triticum aestivum L., сорт Yangmai 158) были получены от Цзянсуйской академии сельскохозяйственных наук (Китай). Нит-ропруссид натрия (НПН, [Na2Fe(CN)5] х NO, "Sigma," США) использовали в качестве донора NO. Семена стерилизовали 1% HgCl2 в течение 3 мин, тщательно промывали и оставляли в воде на 3 дня. Отбирали одинаковые проростки и переносили их на раствор Хогланда [17].
Для изучения токсичности Al проростки с тремя полностью выросшими листьями и одним стеблем переносили на раствор Хогланда, содержавший 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8 или 1 мМ AlCl3 и растили их в темноте при 18 ± 1°С или при 12-часовом освещении (3 клк) и 28 ± 1°С в течение 8 дней. На 8-й день измеряли содержание хлорофилла. При полулетальной концентрации Al содержание хлорофилла снижалось вдвое. Для исследования защитного действия NO на это, вызванное Al снижение содержания хлорофилла проростки выращивали на среде Хогланда с НПН при концентрациях 0, 0.1, 0.2, 0.5 или 1.0 мМ в сочетании с полулетальной концентрацией Al или без Al. Так была подобрана оптимальная концентрация НПН для восстановления содержания хлорофилла в проростках, обработанных Al. Изменения в содержании хлорофилла измеряли на 2-, 4-,
6- и 8-й день при выращивании проростков на полулетальной концентрации Al, оптимальной концентрации НПН и сочетании этих концентрации (Al + НПН). Контролем служили проростки, росшие на воде. Кроме того, при стрессе, вызванном 0.2 мМ Al, анализировали изменения в МДА, H2O2, растворимом белке и пролине, а также активности ферментов антиоксидантной защиты в этих вариантах опыта на 2-, 4-, 6- и 8-й день. Раствор Хогланда (рН 4.4) сменяли ежедневно.
Содержание H2O2 и МДА определяли так, как описано в [16].
Активности супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.1), каталазы (КАТ, КФ 1.11.1.6) и аскорбат-пероксидазы (АПО, КФ 1.11.1.11) измеряли, как описано Garcha-Limones с соавт. [18]. Замороженные листья пшеницы растирали в ледяном 50 мМ буфере (рН 7.8), содержавшем 1.0 мМ ЭДТА. Го-могенат центрифугировали при 15 000 g при 4°C в течение 10 мин. Активность СОД определяли по фотохимическому восстановлению нитросинего тетразолия (НСТ). Активность КАТ определяли спектрофотометрически по снижению абсорбции при 240 нм. Активность АПО измеряли в присутствии 0.5 мМ аскорбиновой кислоты и 0.5 мМ H2O2 по снижению абсорбции при 290 нм.
Содержание хлорофилла и пролина измеряли методом, описанным Ruan с соавт. [19]. Растворимый белок определяли методом Bradford [20].
Достоверность различий оценивали одно- и двухфакторным дисперсионным анализом; результаты выражали средними величинами из трех независимых опытов и их стандартными отклонениями. Каждый опыт повторяли не менее трех раз. Достоверность различий оценивали на основании t-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Содержание хлорофилла в проростках пшеницы служило индикатором токсичности Al. С увеличением концентрации Al оно сильно снижалось за 8 дней опыта (рис. 1). Обработка даже 0.1 мМ Al достоверно снижала содержание хлорофилла (Р < 0.01). 0.2 мМ Al снижал содержание хлорофилла на 50% (полулетальная концентрация).
Проростки пшеницы, подвергнутые алюминиевому стрессу (0.2 мМ Al), обрабатывали НПН, донором NO. НПН предотвращал снижение концентрации хлорофилла, и его эффект зависел от концентрации (рис. 2а). Самое высокое содержание хлорофилла было в проростках, подвергнутых алюминиевому стрессу и обработанных 0.1 мМ НПН: оно приближалось к контрольному варианту. Однако при увеличении концентрации нПн до 0.5 мМ и выше мы не наблюдали его дополнительного защитного влияния; более того, хлорофилл частично разрушался. Это говорит о
0
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
и £ л ч ч к
•е
о &
о ч х <а к м
л *
&
щ
и о
О
(а)
120 г
3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0
К 0 0.1 0.2 0.5 Концентрация НПН, мМ
(б) -Я-
1.0
2 4 6
Длительность обработки, дни
100 80 -
О о
с-Ю
Я«
й I
но
^
ие ок ё 20
60
40
3.0
а
V« 2.5
До £§2.0 ер 1.5
а
1-1
&§1.0
«1 61а5
0
(б)
0 2 4 6
Длительность обработки, дни
Рис. 2. Защитное влияние НПН, донора N0, на содержание хлорофилла в листьях проростков пшеницы, подвергнутых алюминиевому стрессу. а - влияние НПН на содержание хлорофилла в проростках, выращенных на 0.2 мМ А1 в течение 8 дней. Контроль (К) - раствор, не содержавший ни НПН, ни А1. Представлены средние величины из 4 повторно-стей и их стандартные отклонения. Разными буквами отмечены значения, достоверно различающиеся при P < 0.01; б - временные изменения содержания хлорофилла в листьях проростков. 1 - 0.2 мМ А1; 2 - 0.1 мМ НПН + 0.2 мМ А1; 3 - питательный раствор + 0.1 мМ НПН; 4 - питательный раствор.
возможной токсичности высоких концентраций НПН.
На рис. 26 представлен временной ход действия 0.1 мМ НПН на содержание хлорофилла в листьях проростков пшеницы, обработанных А1. А1 снижал вдвое содержание хлорофилла на 6-й день, а в присутствии 0.1 мМ НПН содержание хлорофилла сохранялось на уровне контроля. К 8-му дню хлорофилл начинал разрушаться, хотя его содержание оставалось более высоким, чем без НПН ^ < 0.01). 0.1 мМ НПН сам по себе не влиял на содержание хлорофилла (рис. 26).
Проростки пшеницы, обработанные А1 плюс НПН, содержали заметно меньше Н202, чем при обработке только А1 (рис. 3 а) на протяжении всего опыта, хотя окислительный взрыв проявлялся только в первые два дня. У растений, обработанных только НПН, содержание Н202 так
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.