ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА, 2013, том 39, № 2, с. 92-98
УДК 612.745.1, 612.744.2, 575.1
ВЛИЯНИЕ ОДНОКРАТНОЙ АЭРОБНОЙ НАГРУЗКИ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ В СКЕЛЕТНОЙ МЫШЦЕ У ТРЕНИРОВАННЫХ И НЕТРЕНИРОВАННЫХ МУЖЧИН
© 2013 г. Д. В. Попов1, Р. А. Зиновкин2, Е. М. Каргер2, О. С. Тарасова1, 3, О. Л. Виноградова1
1ФГБУНГНЦРФ — Институт медико-биологических проблем РАН, Москва 2 Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова 3 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Поступила в редакцию 01.12.2012 г.
По современным представлениям белок РОС-1а является ключевым регулятором митохондриаль-ного биогенеза. Механические и метаболические изменения, происходящие в скелетной мышце во время и сразу после аэробных нагрузок, приводят к увеличению экспрессии гена РОС-1а. При этом увеличение экспрессии РОС-1а после нагрузки определяется относительной интенсивностью нагрузки и не зависит от уровня тренированности. Целью исследования было сопоставление экспрессии генов, регулирующих митохондриальный биогенез РОС-1а, ТРАМи ТРБ2М, а также генов, регулирующих индуцируемый аэробной нагрузкой катаболизм мышечных белков, Р0Х01 и Atrogin-1 в скелетной мышце нетренированных и тренированных мужчин после однократной аэробной нагрузки с одинаковой относительной интенсивностью. Показано, что после нагрузки экспрессия РОС-1а не различается между группами, а экспрессия генов ТРАМ и ТРВ2М в нетренированных мышцах больше, чем в тренированных. Напротив, экспрессия генов Р0Х01 и Atrogin-1 увеличилась только в мышцах тренированных людей.
Ключевые слова: аэробная нагрузка, анаэробный порог, экспрессия генов, РОС-1а, ТРАМ, ТРВ2М, РЛХ4, Р0Х01, А^Ш-1.
DOI : 10.7868/S0131164613020124
По современным представлениям, белок PGC-1a (peroxisome proliferator-activated receptor-y (PPARG) coactivator-1a) является ключевым регулятором митохондриального биогенеза [1]. Механические и метаболические изменения, происходящие в скелетной мышце во время и сразу после аэробных нагрузок, приводят к активации сигнальных киназ, таких как аденозинмонофосфат-зависимая протеинкиназа, кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа II типа и митоген-акти-вируемая протеинкиназа p38 [2]. Это, с одной стороны, приводит к увеличению экспрессии гена PGC-1a, а также к активации уже имеющегося в клетке белка PGC-1a. Активированный PGC-1a транслоцируется в ядро, где по механизму положительной обратной связи может участвовать в активации транскрипции своего собственного гена [3, 4]. Помимо этого, PGC-1a участвует в активации целого ряда транскрипционных факторов, в частности, ядерных респираторных факторов 1 и 2 (NRF1 и NRF2). Активация этих факторов, с одной стороны, инициирует экспрессию целого ряда генов, кодирующих белки, участвующие в окислительных реакциях, и регуляции углеводно-жиро-
вого обмена (например, пируватдегидрогеназа 4 (РШ4)) [1, 5, 6]. С другой стороны, NR.F1 и увеличивают экспрессию генов митохондриаль-ных транскрипционных факторов А (ТРАМ), В1 (ТРВ1М) и В2 (ТРВ2М). Эти транскрипционные факторы, в основном TFAM и TFB2M, транслоци-руются в митохондрии и инициируют экспрессию генов, кодируемых митохондриальной ДНК [7].
Было показано, что однократные аэробные упражнения приводят к увеличению экспрессии гена РОС-1а в первые часы восстановления, как в тренированных к аэробным нагрузкам мышцах, так и в нетренированных [8, 9], а также в мышцах людей, страдающих ожирением, и у больных диабетом 2-го типа [10]. При этом оказалось, что если интенсивность нагрузки подбирается относительно величины максимального потребления кислорода организмом (Ко2тах), то относительное увеличение экспрессии этого гена в скелетной мышце не различается у людей с разными функциональными возможностями.
Вместе с тем хорошо известно, что прирост окислительных возможностей мышц в ответ на
аэробную тренировку снижается по мере увеличения исходного уровня аэробной тренированности [11]. Если увеличение экспрессии гена PGC-1a, маркера активации митохондриального биогенеза, не зависит от уровня тренированности, а определяется только относительной интенсивностью нагрузки, то возникает вопрос: почему эффект аэробной тренировки для тренированных мышц меньше, чем для нетренированных?
Целью настоящего исследования было сопоставление экспрессии генов в скелетной мышце нетренированных мужчин и спортсменов, тренирующих аэробные возможности, после однократной аэробной нагрузки, уравненной по относительной интенсивности. Проверялось предположение, что после такой нагрузки, несмотря на сопоставимое увеличение экспрессии PGC-1a, последующие изменения экспрессии генов будут более выраженными в мышцах нетренированных, чем тренированных людей. Для проверки этого предположения нетренированные и тренированные добровольцы выполняли однократную аэробную нагрузку, до и после которой брали пробы мышечной ткани для анализа содержания мРНК генов, регулирующих транскрипцию митохонд-риальной ДНК (TFAMи TFB2M), углеводно-жировой обмен (PDK4), а также индуцируемый аэробной нагрузкой катаболизм мышечных белков (FOXO1, Arogin-1). В качестве тренировочной нагрузки использовали интервальную нагрузку, поскольку показано, что такой способ задания нагрузки более эффективен для стимуляции мито-хондриального биогенеза, чем тренировка с постоянной нагрузкой [12—14].
МЕТОДИКА
В исследовании приняли участие 6 молодых нетренированных мужчин (вес 80(78—82) кг, рост
1.78(1.76-1.82) м, Fo2m„ 42(40-44) мл/мин/кг) и 6 спортсменов-любителей (бег, велоспорт), тренирующих аэробные возможности (вес 68(65-
71) кг, рост 1.78(1.76-1.87) м, Fo2m„ 57(48-63) мл/мин/кг). Испытуемые дали добровольное информированное согласие на участие в эксперименте. Протокол эксперимента был одобрен Комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ -Института медико-биологических проблем РАН.
Во время первого визита в лабораторию испытуемые знакомились с условиями эксперимента. Через два дня каждый из них выполнял тест с непрерывно возрастающей нагрузкой до отказа на велоэргометре Ergometric 900 (Ergoline GmbH, Germany). Начальная нагрузка в тесте составила 0 Вт, скорость возрастания нагрузки - 15 Вт/мин, частота вращения педалей - 60 мин-1. Каждый испытуемый был мотивирован на достижение мак-
симальной мощности. Критерием отказа от продолжения теста были снижение частоты педалирования до 50 мин-1 и увеличение дыхательного коэффициента выше 1.1 (эргоспирометр MetaMax 3B, Cortex GmbH, Germany). Эргоспирометриче-ские данные регистрировались в каждом дыхательном цикле и затем усреднялись за тридцатисе-кундные интервалы; наибольшее значение принималось за FO2mai. Каждые две минуты в течение теста и сразу после прекращения работы из кончика пальца брали пробу капиллярной крови (20 мкл) для определения концентрации лактата. Анаэробный порог (АП) определяли на основании индивидуальной кривой содержания лактата в периферической крови [15].
В основной части исследования каждый испытуемый выполнил однократную аэробную тренировку с интервальной нагрузкой на велоэргометре. Все испытуемые воздерживались от интенсивных аэробных и силовых нагрузок в течение недели до дня эксперимента и от любых тренировочных нагрузок в течение 36 ч до его начала. Тренировочное занятие состояло из разминки (5 мин, 50% АП), основной части (50 мин) и периода восстановления (5 мин, 60% АП). Основная часть занятия состояла из трехминутных периодов нагрузки с интенсивностью 60% АП и двухминутных периодов нагрузки с интенсивностью 91% АП, такой цикл повторялся 10 раз.
Испытуемые приходили в лабораторию в 08:30 и получали стандартный завтрак (3624 кДж; белки : : углеводы : жиры = 24 г : 157 г : 15 г). Физическая нагрузка начиналась через 2 ч 45 мин после завтрака. Через 20 мин после окончания упражнения испытуемые получали стандартный обед (3650 кДж; белки : углеводы : жиры = 29 г : 116 г : 43 г). Во время нагрузки определяли субъективную оценку тяжести работы (СОТ: шкала от 1 до 10 баллов, где 1 -очень легкая работа, 10 - предельно тяжелая работа). Капиллярную кровь для определения содержания лактата брали непосредственно до, а также на 10, 20, 30, 40 и 55 мин упражнения (анализатор Super GL easy, Dr. Müller Gerätebau GmbH, Germany). В пробах крови, полученных до, на 40 и на 55 мин упражнения, также определяли концентрацию не-эстерифицированных жирных кислот (НЭЖК). Содержание НЭЖК в крови оценивали с помощью набора NEFA FS kit (DiaSys Diagnostic Systems GmbH, Germany) на анализаторе Rx Daytona (Ran-dox Laboratories Ltd, UK).
Микробиопсические образцы [16] из m. vastus lateralis брали до и через 3 ч и 5 ч после упражнения. Для локальной анестезии использовали 2 мл 2% лидокаина. Образцы мышечной ткани помещали на фильтровальную бумагу для удаления крови, через 20 с замораживали в жидком азоте и хранили при температуре минус 80°C. Первая биопсийная проба была взята на 12 см проксимальнее condylus
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0 6
А
■ о-Т
н
св
У
св
Л Ч Ч се Ю
H О
и
0 10
8 h
4 -
2 -
20 40
Время, мин
Рис. 1. Содержание неэстерифицированных жирных кислот (А) и лактата (Б) в крови, субъективная оценка тяжести нагрузки и относительная интенсивность тренировочной нагрузки (В) во время интервальной аэробной тренировки у тренированных (Т) и нетренированных (НТ) мужчин.
* и *** отличие от исходного уровня прир < 0.05 ир < <0.001.
Расшифровку аббревиатур см. в разделе "Методика".
lateralis ossis femori. Каждая последующая проба бралась на 2 см проксимальнее предыдущей.
Выделение РНК из образцов мышечной ткани проводили с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen GmbH). Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически при 260 нм. Чистоту РНК оценивали по отношению поглощения света при значениях длины волны 260 нм и 280 нм. После обработки пробы дезоксирибонуклеазой (Fermentas International Inc., Canada), получали комплементарную ДНК, отжигая 2 мкг РНК 50 мин при тем-
пературе 43°C в присутствии 0.1 мкг рандомизированных гексонуклеотидов, 0.1 мкг олиго-дТ прай-меров, и 200 единиц обратной транскриптазы Superscript III (Invitrogen Corporation, USA).
Полимеразную цепную реакц
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.