научная статья по теме ВЛИЯНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА НА ВАКУОЛЯРНУЮ МЕМБРАНУ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА НА ВАКУОЛЯРНУЮ МЕМБРАНУ»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2014, том 31, № 4, с. 263-269

УДК 581.1:577.352

ВЛИЯНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА НА ВАКУОЛЯРНУЮ МЕМБРАНУ

© 2014 г. Н. В. Озолина1*, В. Н. Нурминский1, А. Л. Ракевич2, Е. В. Колесникова1, И. С. Нестёркина1, Л. И. Донская^, Р. К. Саляев1

1Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132;

*электронная почта: ozol@sifibr.irk.ru 2Иркутский филиал Института лазерной физики СО РАН, 664033, Иркутск, ул. Лермонтова. 130а 3Иркутский государственный университет, 664003, Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5 Поступила в редакцию 14.01.2014 г.

С целью изучения роли вакуоли в адаптационных механизмах растительной клетки исследовали динамику биофизических характеристик вакуолярной мембраны под влиянием окислительного стресса. Методом конфокальной микроскопии с использованием флуоресцентных зондов (АНС и лаурдана) показано, что при окислительном стрессе изменяются биофизические характеристики мембраны, а именно, увеличивается микровязкость липидного матрикса вакуолярной мембраны. Одновременно на 40—45% снижается транспортная активность Н+-АТР-азы тонопласта. Окислительный стресс повышал в 2 раза интенсивность флуоресценции зонда АНС при взаимодействии с вакуолярной мембраной, вероятно, вследствие возникновения структурных дефектов в виде неспецифических мембранных пор. Методом цейтраферной видеосъемки показано, что в условиях окислительного стресса значительно уменьшается время полураспада вакуолей, зависящее от интенсивности стресса.

Ключевые слова: вакуолярная мембрана, окислительный стресс, флуоресцентные зонды, конфокальная микроскопия, АНС, лаурдан, Н+-АТР-аза.

Б01: 10.7868/80233475514040070

ВВЕДЕНИЕ

Устойчивость растений к неблагоприятным воздействиям тесно связана с состоянием мембранных структур. Особенности функционирования биологических мембран в условиях стресса и их роль в адаптационных механизмах клетки в настоящее время интенсивно изучается [1]. Большую часть объема растительной клетки занимает вакуоль — полифункциональный компартмент, роль которого в физиолого-биохимических механизмах защиты от стресса мало изучена [2]. Использование флуоресцентных зондов открывает новые возможности в исследовании влияния абиотического стресса на изменения, которые могут происходить в мембранах в ответ на стрессовые воздействия. Методы на основе флуоресцентных зондов в настоящее время используются для диагностики различных заболеваний, особенно часто объектом этих исследований является эритроцитарная мембрана [3, 4]. Цель данного исследования состояла в изучении изменений, происходящих в вакуолярной мембране, в условиях окислительного стресса.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили изолированные вакуоли клеток корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) сорта Бордо, выращенной на опытном участке института. Использовали корнеплоды, находящиеся в стадии покоя, которые хранили в овощехранилище при +4°С. Изолированные вакуоли получали с помощью микрообъемного модифицированного метода [5] в растворе, содержащем: 400 мМ KCl, 10 мМ EDTA, 25 мМ NaH2PO4, рН 8.0, аланин (до 1000 мОсм кг-1 Н2О).

Окислительный стресс создавали реакцией Фентона, приводящей к образованию гидроксиль-ных радикалов. Для этого в суспензию изолированных вакуолей добавляли 50 мМ Н2О2 и 1 мМ FeSO4, после чего инкубировали в течение 30 мин.

Фазовое состояние бислоя мембран изолированных вакуолей изучали на конфокальном люминесцентном сканирующем лазерном микроскопе MicroTime 200 с пикосекундным временным разрешением (PicoQuant GmbH, Германия). С этой целью использовали липофильный зонд — лаурдан (2-(диметиламино)-6-додеканоилнафта-

лин). Применение этого зонда обусловлено тем, что положение максимумов его эмиссии определяется соотношением жидко- и твердофазных областей в мембране. Это соотношение оценивается по величине генерализованной поляризации ^Р) флуоресценции зонда. Для связывания зонда с вакуолярной мембраной к суспензии изолированных вакуолей добавляли лаурдан, растворенный в метаноле, до конечной концентрации 10 мкМ. Суспензию инкубировали при 20 ± 2°С в течение 10 мин. Препараты анализировали на конфокальном микроскопе и рассчитывали величину генерализованной поляризации для каждого пикселя полученного изображения вакуоляр-ной мембраны. Все величины генерализованной поляризации суммировали, рассчитывали среднюю величину и стандартное отклонение.

В экспериментах с флуоресцентным зондом АНС (8-анилино-1-нафталинсульфоновая кислота) к суспензии изолированных вакуолей добавляли зонд в концентрации 10 мкМ в 10% диметил-сульфоксиде. После 30 мин инкубации суспензию анализировали на конфокальном микроскопе, оценивая интенсивность флуоресценции зонда.

Влияние окислительного стресса на барьерные свойства мембран (стабильность мембран) изучали с использованием экспериментальной установки собственного изготовления, позволяющей получать серии компьютерных изображений (цейтраферная видеосъемка, частота кадров 0.1 мин-1 (1 кадр за 10 мин)), отражающих динамику процесса разрушения вакуолей. С помощью компьютерной обработки данных строили график зависимости количества сохранившихся вакуолей (%) от времени и рассчитывали значения периода полураспада изолированных вакуолей, т.е. времени, в течение которого разрушаются 50% вакуолей (Т1/2 отн).

Интактные вакуоли, выделенные из корнеплодов столовой свеклы, интенсивно окрашены и обладают мощной автофлуоресценцией. Барьерные свойства тонопласта также оценивали по изменению интенсивности автофлуоресценции внутреннего содержимого вакуолей, которую определяли на изображениях, полученных с использованием конфокального микроскопа. Флуоресценция внутреннего содержимого вакуолей была сильной — у интактных, яркоокрашенных вакуолей и слабой — у поврежденных, бледно-окрашенных вакуолей. Значение интенсивности флуоресценции оценивали при помощи программы ImageJ. Определяли процентное соотношение количества целых и поврежденных вакуолей. В расчет брали не менее 100 вакуолей в каждом варианте в трех повторностях. Частично поврежденные вакуоли не учитывали.

Влияние окислительного стресса на транспортную функцию протонных насосов изучали

на фракции вакуолярных мембран [5]. Транспортную функцию Н+-АТР-азы тонопласта оценивали по изменению рН везикул тонопласта при помощи флуоресцентного зонда акридинового оранжевого. За сдвигами рН следили по изменению интенсивности флуоресценции этого зонда при длине волны возбуждающего и испускаемого света 493 и 540 нм соответственно. Эксперименты проводили на спектрофлуориметре (RF-5301PC, Shimadzu). В кювету поэтапно вносили 2.5 мл инкубационного раствора и 0.05 мл осадка везикул тонопласта. Инкубационный раствор содержал: 20 мМ Трис/МЭС, 50 мМ KCl, 280 мМ маннит, 5 мкМ акридиновый оранжевый, 3 мМ MgCl2, рН 7.3. Содержание белка определяли по методу Бредфорд [6]. В среднем на 0.05 мл образца приходилось 10—20 мкг белка. В среду инкубации вносили 3 мМ АТР (Трис). Для доказательства специфичности исследований во всех опытах использовали ингибитор Н+-АТР-азы — 50 мМ KNO3, который подавлял активность этого фермента, а также протонофор 10 мкМ карбонилциа-нид-3-хлорофенилгидразон (CCCP), который полностью предотвращал тушение флуоресценции, возникающее при функционировании фермента. Транспортную активность измеряли в %ДF/мг белка/мин, где ДF-тушение флуоресценции акридинового оранжевого [7].

В работе применяли следующие реактивы фирмы Sigma: 2-^морфолино-этансульфоновую кислоту, аденозинтрифосфат (натриевая соль), Трис, 2-меркаптоэтанол, лаурдан, АНС, карбонилциа-нид-3-хлорофенилгидразон. Акридиновый оранжевый фирмы Aldrich. Остальные реактивы были отечественного производства квалификации х.ч.

На графиках представлены средние арифметические значения величин и их стандартные отклонения, полученные в пяти независимых опытах и подсчитанные с помощью программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что практически любой абиотический стресс сопровождается окислительным стрессом, который вызывает наиболее существенные повреждения мембранных структур клетки. В экспериментах была использована фракция изолированных вакуолей, представленная на рис. 1. Эти вакуоли инкубировали с флуоресцентными зондами в контрольных условиях и при искусственно вызванном окислительном стрессе.

На первом этапе методом цейтраферной видеосъемки оценили влияние окислительного стресса на стабильность и барьерные свойства изолированных вакуолей. На рис. 2 приведены результаты этих экспериментов, которые показа-

Рис. 1. Фракция изолированных вакуолей корнеплодов столовой свеклы, полученных микрообъемным способом, которые инкубировали с флуоресцентными зондами (масштабная линейка — 50 мкм).

ли, что для создания значимого окислительного стресса необходимо использовать пероксид водорода в концентрации 50 мМ. Пероксид водорода в концентрации 5 мМ не вызывал статистически значимых отличий в стабильности изолированных вакуолей. Концентрацию 50 мМ использовали во всех дальнейших экспериментах по изучению влияния окислительного стресса на вакуо-лярную мембрану.

Для изучения состояния липидного бислоя в норме и при стрессе в настоящее время широко используются флуоресцентные зонды [4]. Физическое состояние мембранных липидов изучали с помощью зондов, распределяющихся в разных слоях липидного бислоя. Изменение степени упорядоченности липидов (микровязкости) ваку-олярной мембраны при окислительном стрессе оценивали с использованием лаурдана, флуоресцентного зонда, часто применяемого для исследования особенностей структуры мембран [8]. Он обладает способностью к сдвигу спектров эмиссии в зависимости от растворителя или окружения. При преобладании гелевой фазы липидов в мембране максимум эмиссии лаурдана составляет ~440 нм, а при преобладании жидкокристалли-

ческой ~490 нм. По интенсивности флуоресценции зонда в разных частях спектра можно рассчитать величину GP, которая отражает фазовое состояние мембраны. Расчет проводили по формуле [9]:

я 8

60

^50 40

4

св

5 30

св ^

ч 20

о

С

ч 10

о

6 0

Контроль

Н202 5 мМ

Н202 50 мМ

Рис. 2. Вли

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком