научная статья по теме ВЛИЯНИЕ ОПИОИДНЫХ ПЕПТИДОВ НА КИСЛОРОДЗАВИСИМУЮ МИКРОБИЦИДНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ ОПИОИДНЫХ ПЕПТИДОВ НА КИСЛОРОДЗАВИСИМУЮ МИКРОБИЦИДНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ»

ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА, 2012, том 38, № 3, с. 100-106

УДК 612.017.1:615.276.2/4

ВЛИЯНИЕ ОПИОИДНЫХ ПЕПТИДОВ НА КИСЛОРОДЗАВИСИМУЮ МИКРОБИЦИДНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

© 2012 г. С. В. Гейн1, 2, К. Г. Горшкова1

1 Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь 2 Пермский государственный университет Поступила в редакцию 11.04.2011 г.

Исследовано влияние опиоидных пептидов на продукцию активных форм кислорода нейтрофила-ми в нефракционированной лейкоцитарной взвеси и в очищенной фракции нейтрофилов периферической крови. Установлено, что в лейкоцитарной взвеси селективные 8- и ц-агонисты пептидной природы стимулировали спонтанную и угнетали индуцированную зимозаном 15 мкг/мл реакцию (люминолзависимой хемилюминесценции) (ЛЗХЛ) нейтрофилов. в-эндорфин оказывал менее выраженное угнетающее действие на индуцированную зимозаном 15 мкг/мл ЛЗХЛ, 82-агонист Бе^ог-рЫп II стимулировал ЛЗХЛ, индуцированную зимозаном 15 мкг/кг только на 25 мин эксперимента. В очищенной фракции нейтрофилов в-эндорфин и селективные 8- и ц-агонисты не влияли на спонтанную и угнетали активированную зимозаном 15 мкг/мл и 150 мкг/мл ЛЗХЛ нейтрофилов. Таким образом, опиоидные пептиды играют важную роль в процессе прямой и опосредованной регуляции кислород-зависимой системы бактерицидности нейтрофильных гранулоцитов

Ключевые слова: в-эндорфин, опиоидные пептиды, хемилюминесценция, опиатные рецепторы, нейтрофилы.

Эндогенная опиоидная система проявляет чрезвычайно широкий спектр биологической активности, представляя собой одну из важнейших систем регуляции гомеостаза [1]. Ее компоненты, способные действовать как нейромедиаторы, гормоны или модуляторы многих физиологических функций, обнаружены в различных тканях — в нервной системе, надпочечниках, пищеварительном тракте, а также в иммунокомпетентных клетках [2]. Опиоидные пептиды и, в частности, наиболее полифункциональный пептидный гормон р-эндорфина, участвуют в процессах нейро-иммунных взаимодействий и обнаруживают выраженную иммуномодуляторную активность, реализуя свои многочисленные регуляторные эффекты через специфические опиатные сайты связывания трех основных классов ц, 5, к, экспрессия которых на клетках адаптивного и врожденного иммунитета доказана на транскрипционном и трансляционном уровнях [3].

Факторы естественной резистентности являются неспецифической формой защиты от биологической агрессии и формируются в организме до внедрения чужеродных агентов, вне зависимости от их антигенной специфичности. В реализации механизмов естественного иммунитета участвуют клетки миелоидно-моноцитарного ряда — фагоцитирующие гранулоциты и моноциты,

которые обладают выраженной секреторной активностью и могут участвовать в процессах межклеточной кооперации и регуляции иммунного ответа [4]. Одной из важных в функциональном отношении особенностей моноцитов и нейтрофилов является продукция ряда противомикроб-ных факторов — продуктов метаболизма кислорода, образующихся в процессе активации клетки. Активные формы кислорода проявляют выраженную токсичность для соматических и микробных клеток, взаимодействуя с веществами, содержащими участки повышенной электронной плотности. Первичные и вторичные активные формы кислорода, а также метаболиты азота инициируют перекисное окисление липидов мембран, разрушение белков и нуклеиновых кислот микроорганизмов [5]. В результате этого происходит нарушение целостности микробных клеток и разрушение их биомолекул. Особенно важную роль в этом процессе играют нейтрофильные гранулоциты. Данная клеточная популяция составляет 50—60% клеток периферической крови и обладает мощными кислород-зависимой и кислород-независимой системами бактерицидности.

Ранее было показано, что р-эндорфин усиливал фагоцитарную активность [6, 7], модулировал секреторную активность и бактерицидный потенциал моноцитов и нейтрофилов [8]. Показана

ВЛИЯНИЕ ОПИОИДНЫХ ПЕПТИДОВ

101

способность опиоидных пептидов в низких концентрациях (10—7М) налоксонзависимо усиливать образование активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами [9] и стимулировать процессы метаболизма арахидоновой кислоты в нейтрофилах (динорфин А) [10]. В то же

время продукция О- и N0 нейтрофилами, напротив, может снижаться при внесении в культуры р-эндорфина и [Ме^]-энкефалина в более высоких концентрациях (10-3—10-5 М) [11].

Цель настоящей работы — исследовать влияние эндогенного опиоидного пептида р-эндор-фина и синтетических агонистов ц-, 5-рецепто-ров на продукцию активных форм кислорода фракцией лейкоцитов и нейтрофилов периферической крови.

МЕТОДИКА

В качестве объекта исследования использовались лейкоциты периферической венозной крови пяти здоровых женщин-добровольцев в возрасте от 22 до 30 лет. Забор крови производили в эстро-геновую фазу менструального цикла, каждую пробу ставили в трех повторностях.

Получение нефракционированной лейкоцитарной взвеси. Для получения фракции лейкоцитов гепаринизированную венозную кровь отстаивали в течение 2 часов при 37°С. Верхний слой плазмы с лейкоцитами снимали и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 20 мин. Полученный осадок ресуспендировали в 2 мл раствора Хенкса. Доля нейтрофилов в лейкоцитарной суспензии составляла 50—60%.

Получение очищенной фракции лимфоцитов. Выделение фракции нейтрофилов производили на градиенте плотности фиколл-верографин (р = = 1.077) путем наслаивания верхнего слоя плазмы крови с лейкоцитами, полученной отстаиванием гепаринизированной венозной крови в течение 2 часов при 37°С (4 мл на 2 мл смеси фиколл-ве-рографин). Центрифугирование осуществляли при 1500 об/мин в течение 40 мин. После этого, осевшие на дно гранулоциты суспендировали в среде RPMI 1640, дважды отмывали и выдерживали в течение 1 часа при 4°С с целью снятия активации, вызванной выделением. Чистота выделения нейтрофилов оценивалась визуально и составляла 85—95%.

Оценку кислород-зависимой микробицидной активности лейкоцитов осуществляли с использованием реакции люминолзависимой хемилю-минесценции (ЛЗХЛ). Реакцию проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах ('^гетег",

Германия), каждая лунка содержала 105 клеток в 100 мкл раствора Хенкса. В качестве индуктора ЛЗХЛ использовали опсонизированный зимозан в концентрации 15 мкг/мл и 150 мкг/мл. Агонист ц/5-опиатных рецепторов ß-эндорфин ("Sigma", США) вносили в культуры одновременно с индуктором в концентрации 10-7М, ц-агонист опи-атных рецепторов DAGO [(d-Ala2,N-Me-Phe4, Gly5-o/]-энкефалин, "Sigma", США) в концентрации 10-8М; 5-агонист опиатных рецепторов DADLE [(d—Ala2,d-Leu5]-энкефалин, "Sigma", США) в концентрации 10-7М, высокоселективный 52-агониста Deltorphin II (Tyr-d-Ala-Phe-Glu-Val-Val-Gly ]-амид, "Sigma", США) в концентрации 10-7М. Выбор концентраций основан на ранее проведенных исследованиях [12]. В качестве маркера выраженности реакции ЛХЗЛ использовался люминол (10-5М), свечение которого неизбирательно по отношению к различным кислородсодержащим радикалам. Регистрация результатов проводилась в течение часа с помощью многофункционального спектрофотометра

TECAN (Австрия).

Статистический анализ проводили с использованием парного t-критерия Стьюдента. Все данные на рисунках представлены в виде средней (M).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Установлено, что в нефракционированной лейкоцитарной суспензии ß-эндорфин не влиял на спонтанную продукцию активных форм кислорода (рис. 1). В культурах, стимулированных зимозаном в концентрации 15 мкг/мл, пептид угнетал ЛЗХЛ на 15-40-й и 60-й мин реакции. В присутствии высокой концентрации индуктора достоверных эффектов ß-эндорфина на динамику ЛЗХЛ выявлено не было. В то же время селективный 5-агонист DADLE проявил выраженное стимулирующее действие на спонтанную ЛЗХЛ практически на всем отрезке наблюдения и подавлял стимулированную зимозаном 15 мкг/мл ЛЗХЛ, начиная с 20-й мин реакции. Динамику ЛЗХЛ, индуцированную высокой концентрацией зимозана 150 мкг/кг, DADLE не изменял.

Как видно из рис. 2, селективный агонист ц-рецепторов DAGO, подобно DADLE, усиливал спонтанную ЛЗХЛ, подавлял стимулированную зимозаном 15 мкг/мл ЛЗХЛ, начиная с 20-й мин реакции, и не влиял на продукцию активных форм кислорода лейкоцитами в присутствии высокой концентрации индуктора 150 мкг/мл. Высоко селективный 52-агонист опиатных рецепто-

Отн. ед. 250

200

ß-эндорфин

А

150 100

1700 -1200 700 200 5500

4000

2500

1000

Отн. ед. 300

DADLE

J_i_i_i_i_i_i_i_i_i_i_i_i

Б

250 200 150 100

1600 1100 600 100

5500

В

* ** * ** ** ** ** *

_i_i_i_i_i_i_i_i_i_i_i_i_i

4000 -

2500 -

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

1000

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Рис. 1. Влияние ß-эндорфина (левая колонка) и DADLE (правая колонка) на спонтанную (А) и индуцированную зимозаном 15 мкг/мл (Б) и 150 мкг/мл (B) ЛЗХЛ лейкоцитов (n = 5). Здесь и на рис. 2—4: по оси абсцисс — время (мин); черные ромбы — пептид, белые ромбы — контроль. * — p < 0.05; ** — p < 0.01; *** — p < 0.001 к контролю.

ров Deltorphin II не влиял на спонтанную и индуцированную зимозаном 150 мкг/мл продукцию активных форм кислорода, однако статистически значимо стимулировал ЛЗХЛ, индуцированную зимозаном 15 мкг/кг только в одной точке, а именно на 25-й мин реакции.

Несколько иная картина была получена нами во фракции очищенных нейтрофилов. Как видно из рис. 3, ß-эндорфин не влиял на спонтанную ЛЗХЛ нейтрофилов и выраженно угнетал стимулированную ЛЗХЛ. Индуцированную зимозаном 15 мкг/мл ЛЗХЛ пептид снижал на 10-25-й и 35— 40-й мин реакции, а индуцированную зимозаном 150 мкг/мл — на 10—60-й мин реакции. Схожее действие на динамику ЛЗХЛ оказывал ô-агонист

DADLE. Пептид не влиял на спонтанную и выраженно угнетал индуцированную обеими концентрациями зимозана ЛЗХЛ нейтрофилов во временном диапазоне, аналогичном тому, в каком действовал в-эндорфин.

Селективный 5-агонист DAGO (рис. 4) статистически значимо не влиял на спонтанную и индуцированную 15 мкг/мл ЛЗХЛ, но выраженно снижал зимозан-индуцированную (150 мкг/мл) ЛЗХЛ нейтрофилов с 10-й по 60-ю мин эксперимента. В отношении б2-агониста опиатных рецепторов Deltorphin II в культурах очищенных нейтр

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»