ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА, 2012, том 38, № 3, с. 100-106
УДК 612.017.1:615.276.2/4
ВЛИЯНИЕ ОПИОИДНЫХ ПЕПТИДОВ НА КИСЛОРОДЗАВИСИМУЮ МИКРОБИЦИДНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
© 2012 г. С. В. Гейн1, 2, К. Г. Горшкова1
1 Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь 2 Пермский государственный университет Поступила в редакцию 11.04.2011 г.
Исследовано влияние опиоидных пептидов на продукцию активных форм кислорода нейтрофила-ми в нефракционированной лейкоцитарной взвеси и в очищенной фракции нейтрофилов периферической крови. Установлено, что в лейкоцитарной взвеси селективные 8- и ц-агонисты пептидной природы стимулировали спонтанную и угнетали индуцированную зимозаном 15 мкг/мл реакцию (люминолзависимой хемилюминесценции) (ЛЗХЛ) нейтрофилов. в-эндорфин оказывал менее выраженное угнетающее действие на индуцированную зимозаном 15 мкг/мл ЛЗХЛ, 82-агонист Бе^ог-рЫп II стимулировал ЛЗХЛ, индуцированную зимозаном 15 мкг/кг только на 25 мин эксперимента. В очищенной фракции нейтрофилов в-эндорфин и селективные 8- и ц-агонисты не влияли на спонтанную и угнетали активированную зимозаном 15 мкг/мл и 150 мкг/мл ЛЗХЛ нейтрофилов. Таким образом, опиоидные пептиды играют важную роль в процессе прямой и опосредованной регуляции кислород-зависимой системы бактерицидности нейтрофильных гранулоцитов
Ключевые слова: в-эндорфин, опиоидные пептиды, хемилюминесценция, опиатные рецепторы, нейтрофилы.
Эндогенная опиоидная система проявляет чрезвычайно широкий спектр биологической активности, представляя собой одну из важнейших систем регуляции гомеостаза [1]. Ее компоненты, способные действовать как нейромедиаторы, гормоны или модуляторы многих физиологических функций, обнаружены в различных тканях — в нервной системе, надпочечниках, пищеварительном тракте, а также в иммунокомпетентных клетках [2]. Опиоидные пептиды и, в частности, наиболее полифункциональный пептидный гормон р-эндорфина, участвуют в процессах нейро-иммунных взаимодействий и обнаруживают выраженную иммуномодуляторную активность, реализуя свои многочисленные регуляторные эффекты через специфические опиатные сайты связывания трех основных классов ц, 5, к, экспрессия которых на клетках адаптивного и врожденного иммунитета доказана на транскрипционном и трансляционном уровнях [3].
Факторы естественной резистентности являются неспецифической формой защиты от биологической агрессии и формируются в организме до внедрения чужеродных агентов, вне зависимости от их антигенной специфичности. В реализации механизмов естественного иммунитета участвуют клетки миелоидно-моноцитарного ряда — фагоцитирующие гранулоциты и моноциты,
которые обладают выраженной секреторной активностью и могут участвовать в процессах межклеточной кооперации и регуляции иммунного ответа [4]. Одной из важных в функциональном отношении особенностей моноцитов и нейтрофилов является продукция ряда противомикроб-ных факторов — продуктов метаболизма кислорода, образующихся в процессе активации клетки. Активные формы кислорода проявляют выраженную токсичность для соматических и микробных клеток, взаимодействуя с веществами, содержащими участки повышенной электронной плотности. Первичные и вторичные активные формы кислорода, а также метаболиты азота инициируют перекисное окисление липидов мембран, разрушение белков и нуклеиновых кислот микроорганизмов [5]. В результате этого происходит нарушение целостности микробных клеток и разрушение их биомолекул. Особенно важную роль в этом процессе играют нейтрофильные гранулоциты. Данная клеточная популяция составляет 50—60% клеток периферической крови и обладает мощными кислород-зависимой и кислород-независимой системами бактерицидности.
Ранее было показано, что р-эндорфин усиливал фагоцитарную активность [6, 7], модулировал секреторную активность и бактерицидный потенциал моноцитов и нейтрофилов [8]. Показана
ВЛИЯНИЕ ОПИОИДНЫХ ПЕПТИДОВ
101
способность опиоидных пептидов в низких концентрациях (10—7М) налоксонзависимо усиливать образование активных форм кислорода полиморфно-ядерными лейкоцитами [9] и стимулировать процессы метаболизма арахидоновой кислоты в нейтрофилах (динорфин А) [10]. В то же
время продукция О- и N0 нейтрофилами, напротив, может снижаться при внесении в культуры р-эндорфина и [Ме^]-энкефалина в более высоких концентрациях (10-3—10-5 М) [11].
Цель настоящей работы — исследовать влияние эндогенного опиоидного пептида р-эндор-фина и синтетических агонистов ц-, 5-рецепто-ров на продукцию активных форм кислорода фракцией лейкоцитов и нейтрофилов периферической крови.
МЕТОДИКА
В качестве объекта исследования использовались лейкоциты периферической венозной крови пяти здоровых женщин-добровольцев в возрасте от 22 до 30 лет. Забор крови производили в эстро-геновую фазу менструального цикла, каждую пробу ставили в трех повторностях.
Получение нефракционированной лейкоцитарной взвеси. Для получения фракции лейкоцитов гепаринизированную венозную кровь отстаивали в течение 2 часов при 37°С. Верхний слой плазмы с лейкоцитами снимали и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 20 мин. Полученный осадок ресуспендировали в 2 мл раствора Хенкса. Доля нейтрофилов в лейкоцитарной суспензии составляла 50—60%.
Получение очищенной фракции лимфоцитов. Выделение фракции нейтрофилов производили на градиенте плотности фиколл-верографин (р = = 1.077) путем наслаивания верхнего слоя плазмы крови с лейкоцитами, полученной отстаиванием гепаринизированной венозной крови в течение 2 часов при 37°С (4 мл на 2 мл смеси фиколл-ве-рографин). Центрифугирование осуществляли при 1500 об/мин в течение 40 мин. После этого, осевшие на дно гранулоциты суспендировали в среде RPMI 1640, дважды отмывали и выдерживали в течение 1 часа при 4°С с целью снятия активации, вызванной выделением. Чистота выделения нейтрофилов оценивалась визуально и составляла 85—95%.
Оценку кислород-зависимой микробицидной активности лейкоцитов осуществляли с использованием реакции люминолзависимой хемилю-минесценции (ЛЗХЛ). Реакцию проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах ('^гетег",
Германия), каждая лунка содержала 105 клеток в 100 мкл раствора Хенкса. В качестве индуктора ЛЗХЛ использовали опсонизированный зимозан в концентрации 15 мкг/мл и 150 мкг/мл. Агонист ц/5-опиатных рецепторов ß-эндорфин ("Sigma", США) вносили в культуры одновременно с индуктором в концентрации 10-7М, ц-агонист опи-атных рецепторов DAGO [(d-Ala2,N-Me-Phe4, Gly5-o/]-энкефалин, "Sigma", США) в концентрации 10-8М; 5-агонист опиатных рецепторов DADLE [(d—Ala2,d-Leu5]-энкефалин, "Sigma", США) в концентрации 10-7М, высокоселективный 52-агониста Deltorphin II (Tyr-d-Ala-Phe-Glu-Val-Val-Gly ]-амид, "Sigma", США) в концентрации 10-7М. Выбор концентраций основан на ранее проведенных исследованиях [12]. В качестве маркера выраженности реакции ЛХЗЛ использовался люминол (10-5М), свечение которого неизбирательно по отношению к различным кислородсодержащим радикалам. Регистрация результатов проводилась в течение часа с помощью многофункционального спектрофотометра
TECAN (Австрия).
Статистический анализ проводили с использованием парного t-критерия Стьюдента. Все данные на рисунках представлены в виде средней (M).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Установлено, что в нефракционированной лейкоцитарной суспензии ß-эндорфин не влиял на спонтанную продукцию активных форм кислорода (рис. 1). В культурах, стимулированных зимозаном в концентрации 15 мкг/мл, пептид угнетал ЛЗХЛ на 15-40-й и 60-й мин реакции. В присутствии высокой концентрации индуктора достоверных эффектов ß-эндорфина на динамику ЛЗХЛ выявлено не было. В то же время селективный 5-агонист DADLE проявил выраженное стимулирующее действие на спонтанную ЛЗХЛ практически на всем отрезке наблюдения и подавлял стимулированную зимозаном 15 мкг/мл ЛЗХЛ, начиная с 20-й мин реакции. Динамику ЛЗХЛ, индуцированную высокой концентрацией зимозана 150 мкг/кг, DADLE не изменял.
Как видно из рис. 2, селективный агонист ц-рецепторов DAGO, подобно DADLE, усиливал спонтанную ЛЗХЛ, подавлял стимулированную зимозаном 15 мкг/мл ЛЗХЛ, начиная с 20-й мин реакции, и не влиял на продукцию активных форм кислорода лейкоцитами в присутствии высокой концентрации индуктора 150 мкг/мл. Высоко селективный 52-агонист опиатных рецепто-
Отн. ед. 250
200
ß-эндорфин
А
150 100
1700 -1200 700 200 5500
4000
2500
1000
Отн. ед. 300
DADLE
J_i_i_i_i_i_i_i_i_i_i_i_i
Б
250 200 150 100
1600 1100 600 100
5500
В
* ** * ** ** ** ** *
_i_i_i_i_i_i_i_i_i_i_i_i_i
4000 -
2500 -
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
1000
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Рис. 1. Влияние ß-эндорфина (левая колонка) и DADLE (правая колонка) на спонтанную (А) и индуцированную зимозаном 15 мкг/мл (Б) и 150 мкг/мл (B) ЛЗХЛ лейкоцитов (n = 5). Здесь и на рис. 2—4: по оси абсцисс — время (мин); черные ромбы — пептид, белые ромбы — контроль. * — p < 0.05; ** — p < 0.01; *** — p < 0.001 к контролю.
ров Deltorphin II не влиял на спонтанную и индуцированную зимозаном 150 мкг/мл продукцию активных форм кислорода, однако статистически значимо стимулировал ЛЗХЛ, индуцированную зимозаном 15 мкг/кг только в одной точке, а именно на 25-й мин реакции.
Несколько иная картина была получена нами во фракции очищенных нейтрофилов. Как видно из рис. 3, ß-эндорфин не влиял на спонтанную ЛЗХЛ нейтрофилов и выраженно угнетал стимулированную ЛЗХЛ. Индуцированную зимозаном 15 мкг/мл ЛЗХЛ пептид снижал на 10-25-й и 35— 40-й мин реакции, а индуцированную зимозаном 150 мкг/мл — на 10—60-й мин реакции. Схожее действие на динамику ЛЗХЛ оказывал ô-агонист
DADLE. Пептид не влиял на спонтанную и выраженно угнетал индуцированную обеими концентрациями зимозана ЛЗХЛ нейтрофилов во временном диапазоне, аналогичном тому, в каком действовал в-эндорфин.
Селективный 5-агонист DAGO (рис. 4) статистически значимо не влиял на спонтанную и индуцированную 15 мкг/мл ЛЗХЛ, но выраженно снижал зимозан-индуцированную (150 мкг/мл) ЛЗХЛ нейтрофилов с 10-й по 60-ю мин эксперимента. В отношении б2-агониста опиатных рецепторов Deltorphin II в культурах очищенных нейтр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.