ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 6, с. 669-675
= ГЕНЕТИКА =
УДК 575.2.084:582.5421
ВЛИЯНИЕ ПАРАМЕТРОВ БИОЛИСТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ЯРОВОГО ЯЧМЕНЯ (Hordeum vulgare L.) НА УРОВЕНЬ ТРАНЗИЕНТНОЙ ЭКСПРЕССИИ РЕПОРТЕРНОГО ГЕНА GFP
© 2007 г. М. Ä. Чернобровкина, Е. Ä. Сидоров, И. Ä. Баранов, П. Н. Харченко, С. В. Долгов
Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии, 127550 Москва, Тимирязевская ул., 42
E-mail: chernobrovkina@yandex.ru Поступила в редакцию 11.09.2006 г.
Изучено влияние параметров биолистической трансформации (давление гелия, при котором происходит разрыв дисков, разрежение воздуха в камере, расстояние между останавливающим экраном и мишенью, субстанции (золото/вольфрам), размер микроносителей, время прекультивации экс-плантов перед процедурой обстрела) на уровень транзиентной экспрессии репортерного гена GFP в зародышах ячменя. Самый высокий уровень транзиентной экспрессии был достигнут в результате прекультивации эксплантов в течение 12-14 сут перед обстрелом и бомбардировки микрочастицами золота размером 1 мкм при давлении гелия 61.24-74.85 атм, разрежении в камере 0.064 атм и расстоянии до мишени 9 см.
Главная цель генетической трансформации -получение новых форм растений с улучшенными свойствами. Однако трансформация злаков весьма проблематична, так как в целом клетки и ткани однодольных растений с большим трудом поддаются регенерации в культуре in vitro и агробак-териальной трансформации. Первыми были получены трансгенные растения риса и кукурузы. После разработки биолистического метода трансформации в начале 90-х гг. XX в. была получена трансгенная пшеница (Vasil et al., 1992). Ячмень был последним из основных зерновых злаков, в которые осуществлен перенос ДНК, так как при культивировании in vitro ячмень быстро теряет способность к регенерации (Wan, Lemaux, 1994). Обзор сведений о переносе гетерологич-ных генов в растения ячменя опубликован в ряде работ (Lemaux et al., 1998; Horvath, 2001; Lorz et al., 2000). Однако эти результаты получены при трансформации модельного сорта ячменя Golden Promise, который отличается высокой способностью к регенерации в культуре in vitro, но не имеет хозяйственно полезных признаков. При трансформации коммерчески важных сортов возникает необходимость подбора индивидуальных условий переноса гетерологичных генов ввиду значительного влияния генотипа на эффективность трансформации (Patnaik, Khurana, 2001).
Основой биолистического метода является прямой перенос генетического материала в растительные клетки путем бомбардирования эксплантов покрытыми ДНК золотыми либо вольфрамовыми частицами с помощью высокого давления сжатого газа (свыше 25 атм). Эффективность био-
листической трансформации в определенной степени зависит от таких физических параметров, как скорость частиц, их размер и число, а также количество нанесенной ДНК (Sanford et al., 1993). Среди биологических параметров, влияющих на эффективность трансформации, наиболее важными являются тип эксплантов, их осмотическое состояние и длительность периода инкубации на культу-ральной среде до обстрела (Klein, Jones, 1999).
Оптимальная эффективность переноса гете-рологичной ДНК в клетки растений достигается при определенном соотношении между силой проникновения частиц и степенью поранения ткани-мишени. Установление этого соотношения может занять довольно длительный период времени. Оптимизация параметров обстрела происходит наиболее эффективно при возможности быстрой идентификации протрансформирован-ных клеток. Удобным способом оценки эффективности доставки ДНК в интактные клетки является определение количества клеток с транзи-ентной экспрессией репортерного гена (Hunold et al., 1994). Целью исследований по оптимизации протоколов трансформации является достижение высокой частоты транзиентной экспрессии. При этом очень важно, чтобы ткани мишени не слишком сильно повреждались в результате бомбардировки (Zuker et al., 1995; Tadesse et al., 2003). Степень повреждения тканей зависит от типа экс-планта, плотности частиц и давления газа при разгоне частиц (Casas et al., 1993; Able et al., 2001; Ikea et al., 2003; Tadesse et al., 2003).
До недавнего времени наиболее распространенным репортерным геном при трансформации
растений являлся бактериальный ген UidA (GUS), клонированный из E. coli К12 и кодирующий фермент ß-глюкуронидазу. Этот фермент представляет собой гидролазу, катализирующую расщепление ß-глюкуронидов, многие из которых являются коммерческими препаратами и используются в качестве субстратов для спектро-фотометрического, флюориметрического и гистохимического анализов (Jefferson et al., 1986). Главным недостатком данного репортерного гена является то, что растительная ткань в результате гистохимического анализа погибает. Кроме того, многие виды растений, в частности, такие злаковые культуры, как ячмень и пшеница, обладают эндогенной GUS-подобной активностью (Hu et al., 1990), что накладывает некоторые ограничения на использование этого гена. Фермент ß-глюкуронидаза очень стабилен в экстрактах и клетках. Он способен сохраняться дни и недели после прекращения транскрипции и трансляции, что является недостатком при изучении экспрессии генов (Webb, Morris, 1992).
Ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), клонированный из медузы (Aequora victoria), был успешно использован для оценки транзиентной экспрессии (Elliott et al., 1999) и оптимизации протоколов трансформации разных видов растений (Heim, Tsein, 1996; Ponappa et al., 1999; Able et al., 2001; Jeoung et al., 2002). К преимуществам этого репортерного гена можно отнести простоту визуальной детекции, возможность наблюдать его экспрессию в интактных тканях и отсутствие необходимости добавления экзогенных субстратов. После ряда модификаций ген GFP был адаптирован в качестве маркерного для злаковых растений (Pang et al., 1996) и в настоящее время является наиболее удобным маркером при трансформации злаков.
Целью наших исследований являлась оптимизация параметров биолистической трансформации ячменя путем оценки уровня транзиентной экспрессии репортерного гена GFP.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объекты исследований. Исследования проводили на сортах ярового ячменя пивоваренного направления (Стимул, Мамлюк, Виконт) селекции Краснодарского НИИ сельского хозяйства. До-норные растения выращивали в зимних теплицах при 16-часовом световом периоде, при температуре 21-24°С днем и 16-18°С ночью и соблюдении необходимых агротехнических мероприятий.
Культура in vitro. В качестве эксплантов использовали незрелые зародыши ячменя. Незрелые колосья донорных растений собирали через 12-15 сут после начала цветения, отделяли зерновки от стержня и помещали их в 70%-ный (объ-
ем/объем) раствор этанола на 1 мин. После этого зерновки стерилизовали в 30%-ном растворе (объем/объем) коммерческого препарата Белизна (Россия) в течение 30 мин и затем трижды промывали стерильной дистиллированной водой.
В асептических условиях из поверхностно стерилизованных зерновок под бинокуляром извлекали зародыши с помощью скальпеля. Зародыши помещали на питательную среду в чашки Петри диаметром 10 см щитком вверх (по 30-40 шт. в одну чашку).
Питательные среды стерилизовали автокла-вированием при давлении в 0.8-1.0 атмосфер, при температуре 120°С в течение 20 мин. Перед авто-клавированием рН питательной среды доводили до значения 5.8 с помощью 1 N КОН. Регуляторы роста и витамины стерилизовали фильтрованием (фильтр Millipore (США), 0.22 мкм) и добавляли в остывающую после автоклавирования среду.
Прекулътивация эксплантов. Для проведения генетической трансформации ячменя незрелые зародыши культивировали на среде для индукции каллусообразования (ИКО), содержащей соли по прописи Мурасиге-Скуга (MS) и дополненной 30 г/л мальтозы, 1.0 мг/л тиамин-хлорида, 0.5 мг/л пиридоксина, 0.25 мг/л мио-инозитола, 1.0 г/л гид-ролизата казеина, 2.5 мг/л 2.4-Д и 0.5 мг/л 6-БАП. За 4-6 ч до обстрела зародыши перекладывали на осмотическую среду (ИКО, дополнительно содержащую маннитол и сорбитол в концентрации 0.4 М) (рис. 1).
Векторная конструкция. В экспериментах по трансформации ячменя использовали векторную конструкцию psGFP-BAR, содержащую ген GFP под промотором Act 1 риса (McElroy et al., 1990) и ген BAR под промотором Ubi 1 кукурузы (Christensen et al, 1996) (рис. 2).
Подготовка ДНК и обстрел частицами. Осаждение плазмидной ДНК на микрочастицы и процедуру биолистического обстрела проводили согласно инструкции производителя прибора Biolis-ticTM PDS/1000 Helium System (BioRad, США) (Kikkert, 1993). Перед обстрелом 5 мг микрочастиц (из расчета на 10 выстрелов) помещали в пробирку объемом 1.5 мл и добавляли к навеске 300 мкл 70%-ного этанола. Суспензию размешивали на вортексе в течение 5 мин, центрифугировали в течение 10 с на центрифуге MICRO CENTAUR (Sanyo, Япония) при 13000 об/мин и отбирали супернатант. К осадку добавляли 300 мкл mQ-H2O (деионизированная вода) и повторяли описанную выше процедуру 3 раза. Осажденные таким образом частицы ресуспендировали в 25 мкл mQ-H2O, после чего добавляли 5 мкл плаз-мидной ДНК (1 мкг/мкл), 25 мкл 2.5 М CaCl2 и 10 мкл 0.2 М спермидина. Смесь перемешивали 3 мин на вортексе, осаждали в течение 10 с при 13000 об/мин и удаляли супернатант. Осадок про-
Рис. 2. Схематическое изображение векторной конструкции psGFP-BAR: Act 1 - промотор гена Act 1 из генома риса; intron - регуляторная последовательность; Ubi 1 - промотор гена Ubi 1 из генома кукурузы.
psGFP-BAR
Act 1 intron ЩGFP Ubi 1 intron ^AR
Рис. 1. Экспланты ячменя, перенесенные на осмотическую среду и сгруппированные в качестве мишени для обстрела в центре чашки.
мывали 250 мкл абсолютного этанола и ресуспен-дировали в 50 мкл абсолютного этанола. В центр макроносителя помещали 5 мкл образца из аликвоты, подсушивали в потоке воздуха лами-нар-бокса и использовали для обстрела.
Оптимизацию физических параметров проводили по следующим показателям: давление гелия в момент разрыва дисков (30.62, 44.23, 61.24, 74.85, 91.86 и 102.1 атм); р
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.