ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 5, с. 513-516
УДК 664.955.2
ВЛИЯНИЕ ПАСТЕРИЗАЦИИ НА АКТИВНОСТЬ ПРОТЕИНАЗ
ИКРЫ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ
© 2004 г. Л. Р. Копыленко, Т. Е. Рубцова
Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии, Москва, 107140;
e-mail: vnirotest@ru Поступила в редакцию 16.02.2003 г.
Исследована зависимость активности и стабильности протеолитических ферментов икры лососевых рыб от рН и температуры. Наибольшая протеолитическая активность ферментов икры обусловлена протеиназами, активными в кислой зоне рН с оптимумом при 3.6. Результаты исследований подклассовой принадлежности протеолитических ферментов в икре лососевых рыб и имеющиеся литературные сведения позволяют предположить, что активность протеиназ может быть связана с присутствием аспартильных протеиназ типа катепсина D. В икре не обнаружены сериновые проте-иназы и металлоферменты, выявлена незначительная активность цистеиновых протеиназ. Разработанный режим пастеризации обеспечивал полную инактивацию протеиназ икры лососевых рыб при рН 6.0-6.4.
В последние годы резко снизилось качество зернистой икры лососевых рыб [1]. В определенной степени это связано с нарушением технологии производства, хранения, транспортировки и перефасовывания икры в потребительскую тару. В этой связи становится актуальным вопрос пастеризации икры с целью подавления нежелательного роста микробных клеток.
О возможности использования пастеризации для икры лососевых рыб сообщалось ранее [2-6]. Однако технология пастеризации не была внедрена. Предлагаемые режимы пастеризации снижали микробную обсемененность икры, но ослабляли оболочку икринок и способствовали потемнению икры в процессе хранения. Нами была предпринята попытка оптимизировать условия пастеризации и при этом максимально сохранить качество готовой продукции. Для этого необходимо было исследовать влияние пастеризации на микрофлору икры и на активность протеолитических ферментов.
В процессе хранения икры рыб, в том числе лососевых, происходят изменения, обусловленные микробными, окислительными и ферментативными процессами, которые приводят к ухудшению ее качества [7-10].
В то время как вопросам микробных изменений посвящен ряд работ [11, 12], сведения об активности ферментов икры лососевых рыб немногочисленны [13-15], а о роли ферментов икры в процессе технологической обработки отсутствуют.
Цель работы - изучение влияния пастеризации на активность протеиназ икры лососевых рыб, а также возможности регулирования протеолитичес-кой активности в процессе ее обработки и хранения.
МЕТОДИКА
В качестве объектов исследования использовали мороженую, соленую и пастеризованную икру лососевых рыб: горбуши (ОпсотНупоНш gor-ЬшсНа), кеты (ОпсогНупсНш кега), кижуча (Опсо-гНупсНш kisuhch) и нерки (ОпсогНупсНш пегка).
Икру растирали в фарфоровой ступке, водорастворимые белки икры экстрагировали 0.15 М КаС1 при температуре от 0 до -2°С и через 30 мин центрифугировали при 16000 § в течение 20 мин, удаляли верхнюю жировую пленку и фильтровали через бумажный фильтр.
Общую протеолитическую активность растворимых белков икры определяли по методу Ансона [16]. К 0.2 мл экстракта добавляли 0.6 мл 0.1 М трис-буфера (рН 3.6), 0.2 мл субстрата (1%-ный раствор гемоглобина или 1%-ный раствор казеина), и смесь инкубировали при 37°С в течение 1ч. Реакцию останавливали добавлением 0.3 мл 10%-ного раствора ТХУ. В контрольных вариантах ТХУ добавляли к смеси одновременно с экстрактом. Полученную смесь помещали на 10 мин в холодильную камеру для формирования осадка, который отделяли центрифугированием при 8000 § 20 мин. К 0.3 мл полученного суперна-танта добавляли 0.6 мл 0.5 М КаОИ и 0.18 мл 0.7 н. реактива Фолина. Через 5 мин определяли оптическую плотность реакционной смеси при 750 нм. За 1 единицу протеолитической активности (усл. ед.) принимали то количество икры, которое приводило к увеличению оптической плотности в фильтрате на 0.01 при 750 нм в описанных выше условиях.
Белок определяли по методу Лоури, используя в качестве стандарта БСА.
Рис. 1. Зависимость активности протеиназ (усл. ед./мг белка) икры горбуши от рН, субстраты: 1 - гемоглобин, 2 - казеин.
При определении зависимости активности протеиназ от рН использовали универсальный буфер (рН 2.0), фосфатно-цитратный (рН 2.27.2), 0.2 М боратный (рН 7.2-8.0) и 0.05 М борат-ный (рН 9.0-11.0) буферные растворы. В качестве природных субстратов использовали гемоглобин кристаллический из лошадиной крови и казеин ("Serva", Германия), что связано с ограниченной растворимостью каждого из них при определенных значениях рН.
При определении стабильности протеиназ икры при различных значениях рН пробы доводили до нужного значения рН указанными выше буферными растворами и проводили преинкубацию в течение 1 ч при 25°C. После этого рН в каждой пробе доводили до 3.6, разбавляли до определенной концентрации белка и производили по 2 параллельных определения протеолитической активности в экстрактах при каждом значении рН.
Зависимость активности протеиназ икры от температуры определяли при рН 3.6 и различных температурах (инкубация - 1 ч).
Исследование влияния температуры на стабильность протеиназ проводили, инкубируя 1 мл экстракта икры при рН 3.6 и различных значениях температуры в течение 10 мин, а затем определяли остаточную активность ферментов.
Для определения подклассовой принадлежности протеолитических ферментов, выявленных в икре, использовали ингибиторный анализ с применением специфических ингибиторов протеиназ соответствующих подклассов: в качестве ингибитора сериновых протеиназ - фенилметилсульфо-
Рис. 2. Стабильность протеиназ икры горбуши в зависимости от рН, субстраты: 1 - гемоглобин, 2 - казеин. Прединкубация в течение 1 ч при 25°С.
нилфторид ("Serva", Германия) и ингибитор Кунитца ("Reanal", Венгрия), цистеиновых протеиназ - п-хлормеркурийбензоат, йодацетамид, аспартильных протеиназ - пепстатин ("Sigma", США) и металлопротеиназ - ЭДТА ("Serva", Германия). Концентрация всех вышеперечисленных ингибиторов составляла 1 х 10-3 М. Оценивая влияние тех или иных ингибиторов, вычисляли долю (% от контроля) остаточной активности фермента (экстракт в присутствии ингибитора инкубировали при рН 3.6 и 25°C в течение 1ч).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Зависимость активности протеолитических ферментов от рН в диапазоне от 2.0 до 10.6 представлена на рис. 1. Наибольшую протеолитичес-кую активность проявляли ферменты икры, активные в кислой зоне рН с оптимумом рН 3.6. При значениях рН, характерных для свежей икры (6.0-6.4), уровень активности был значительно ниже. Активность протеиназ в щелочной области рН (8.4-11.0) не была обнаружена.
Результаты изучения зависимости стабильности протеиназ от рН указывали на значительную их устойчивость при кислых значениях рН - от 3.5 до 4.5 и лабильность - при щелочных значениях рН (рис. 2).
Как показано на рис. 3, наибольшая активность протеиназ выявлена в диапазоне температур 33-37°C с оптимумом рН при 35°C. Оптимум активности для протеиназ форели наблюдался при температуре 45°C [13-16]. Высокая термостабильность протеиназ икры лососевых рыб
ВЛИЯНИЕ ПАСТЕРИЗАЦИИ
515
усл. ед./мг 25
20
15
10
5
0 20 40 60 80 100
°С
Рис. 3. Зависимость активности (1) протеиназ икры
горбуши от температуры и ее термостабильность (2).
проявлялась в интервале температур 25-35°С, затем она резко, более, чем в 10 раз снижалась -(рис. 3). При 65°С сохранялось менее 5% активности.
Для определения подклассовой принадлежности протеолитических ферментов лососевой икры исследовали действие специфических ингибиторов на ферменты икры лососевых рыб (таблица).
ЭТДА в концентрации 10-3 М не оказывал ин-гибирующего действия на ферменты икры, что может свидетельствовать об отсутствии в икре лососевых рыб металлопротеиназ. Ингибирую-щего эффекта фенилметилсульфонилфторида и ингибитора Кунитца на протеиназы икры также не выявлено, что может указывать на отсутствие сериновых протеиназ в икре лососевых рыб. Эти данные согласуются с результатами изучения протеиназ икры форели и сига [13, 14].
Парахломеркурийбензоат, оказывающий инги-бирующее действие на цистеиновые протеиназы, незначительно (на 12%) инактавировал протеиназы икры лососевых рыб. Иодацетамид, также обычно ингибирующий цистеиновые протеиназы, подавлял активность протеиназ на 26%. Это, по-видимому, позволяет предположить присутствие в икре лососевых рыб цистеиновых протеиназ. Ранее было показано, что активирующий агент, цистеин, активирует протеиназы икры форели на 25% [15].
Из исследованных ингибиторов существенное инактивирующее действие на протеиназы икры оказывал лишь пепстатин, являющийся специфическим ингибитором аспартильных протеиназ.
Рис. 4. Зависимость активности протеиназ от рН пастеризованной (1, 2) и непастеризованной (3, 4) икры горбуши 1, 3 - гемоглобин; 2, 4 - казеин.
После инкубации с пепстатин ом (10-3 М) сохранилось лишь 8.6% активности протеиназ. Это позволило придти к заключению, что протеоли-тическая активность в икре лососевых рыб в основном связана с присутствием аспартильных протеиназ предположительно типа катепсина Б [15, 17]. Следует отметить, что катепсин Б был обнаружен в икре форели, сига [13, 14] и осетровых рыб [18].
Зависимость от рН активности протеиназ пастеризованной и непастеризованной икры горбуши представлена на рис. 4. Аналогичные результаты были получены нами при исследовании икры кеты, кижуча и нерки. Наибольшая активность выявлена при рН 3.6, которая составляла для кеты 17.30, для горбуши 11.36, для нерки 11.23 усл. ед. содержание белка в экстракте 18.36-18.60 мг/мл).
Действие специфических ингибиторов протеиназ на ферменты икры лососевых рыб
Ингибитор Концентрация, М Активность, %
Без ингибитора 0 100.0
ЭДТА 1 х 10-3 101.7
Фенилметилсуль-фонилфторид 1 х 10-3 100.0
Ингибитор Кунитца 1 х 10-3 97.0
Парахлормерку-рийбензоат 1 х 10-3 88.0
Иодацетамид 1 х 10-3 74.2
Пепстатин 1 х 10-3 8.6
При пастеризации наблюдалось снижение активности протеиназ при рН 3.6 на 88.4%, 46.9 и 24.3%, для икры кеты, кижуча и нерки соответственн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.