БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2012, том 29, № 3, с. 195-199
УДК 577.35
ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА Thr-Ser-Lys-Tyr НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ИЗОЛИРОВАННЫХ НЕЙРОНОВ Ьутнага Бга^аШ Ь.
© 2012 г. Н. А. Ивличева1, Л. И. Крамарова2, Р. Х. Зиганшин3, В. Г. Цыганова2,
В. В. Рогачевский1, Э. Н. Гахова1*
Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино, Московская обл., Институтская ул., 3;
*электронная почта:gakhova@gmail.com 2Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино, Московская обл.,
Институтская ул., 3
3Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 06.07.2011 г. После доработки 02.11.2011 г.
Пептиды — регуляторы естественного гипобиоза, выделенные из головного мозга зимоспящих животных, могут быть использованы для создания эффективных технологий подготовки биоматериала к длительному сохранению в жизнеспособном состоянии при низких и сверхнизких температурах (криоконсервация). В представленной работе изучена возможная роль пептида ТЬг-8ег-Ьуз-Туг (Т£КУ), выделенного нами из мозга зимоспящих сусликов (БрвгторЫПш undulatus), в индукции механизмов защиты нервных клеток на стадии подготовки к криосохранению. Изучено влияние данного пептида на физиологическое состояние изолированных нейронов прудовика (Lymnaea stagnalis Ь.) в клеточной культуре. Показано значительное увеличение общего количества живых нейронов в культуре после обработки мозга пептидом Т$КУ как при 22—24°С, так и при 4—6°С. Однако количество нейронов, формирующих отростки, в процентном отношении к этому общему количеству живых нейронов было ниже, чем в контроле, что, возможно, свидетельствует о снижении метаболической и функциональной активности нейронов под воздействием пептида Т8КУ
Ключевые слова: гипобиоз, пептид Т8КУ, культура нейронов моллюска, жизнеспособность клеток.
Решение задач низкотемпературной и околонулевой консервации биоматериала связано с использованием криопротекторов различной химической природы. Их присутствие способствует сохранению жизнеспособности замораживаемого объекта. Известно, что в состоянии зимней спячки организм не только способен адаптироваться и противостоять холодовому стрессу, но и защищен от действия радиации, различных инфекций, онкологических заболеваний и атрофии мышц [1—4]. Использование природных факторов адаптации позвоночных животных к околонулевым и сверхнизким температурам для сохранения тканей, органов и организмов позволит создать эффективную технологию подготовки биоматериала для криомедицины и криобиологии [5]. Изучение нейропротекторных механизмов у зимоспящих животных позволит разработать подходы к сохранению мозга человека в экстремальных условиях, новые стратегии терапии при инсульте, травмах мозга и различных нейро-дегенеративных заболеваниях, а также улучшить условия хранения органов до трансплантации. Проводится поиск нетоксичных и эффективных
криозащитных средств, накапливается все больше данных о важной роли физиологического состояния клеток перед глубоким замораживанием или трансплантацией ткани и органов. Следовательно, основное внимание должно уделяться тщательной подготовке объектов, предназначенных для длительного сохранения при околонулевых и низких температурах. Внимание исследователей привлекло использование пептидов, выделенных нами из мозга зимоспящих животных, которые, по-видимому, способны индуцировать состояние гипобиоза [6—8, 12].
В представленной работе изучено влияние пептида Т8КУ на жизнеспособность изолированных нейронов прудовика (Lymnaea stagnalis Ь.) в клеточной культуре.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пептид Т8КУ был выделен из мозга зимоспящих сусликов SpermophШus undulatus, а затем синтезирован классическим методом [7].
Изолированное окологлоточное нервное кольцо прудовика предварительно инкубировали
195
4*
196
ИВЛИЧЕВА и др.
Рис. 1. Изолированный нейрон из мозга прудовика Ь. stagnalis Ь. после культивирования в течение 24 ч без предварительной обработки мозга пептидом (а) и с предварительной инкубацией мозга в растворе с пептидом Т8КУ в течение 60 мин (б).
в течение 60 мин в растворе питательной среды (20% L-15 Medium Leibovitz) (L4386 Sigma, США) с добавлением пептида TSKY (1 х 10-5, 1 х 10-6 и 1 х 10-7 М) при 22—24°С и при 4-6°С. Затем нейроны выделяли из мозга моллюска по методу Ко-стенко М.А. [9] и культивировали при 22-24°С в среде для нейронов прудовика (КСНП) (мМ): NaCl - 90, KCl - 5, CaCl2 - 2, MgCl2 - 1.5 (Sigma, США); трис-HCl - 0.25 мМ (Sigma, США), рН 7.6-7.9, содержащей 20% L-15 и 20 мкг/мл гента-мицина [9, 10]. В контроле мозг предварительно инкубировали в растворе без пептида. Целостность клеточных мембран нейронов оценивали по проницаемости для витального красителя (ме-тиленовый синий). Поврежденные нейроны также легко определяли по явным признакам лизиса, вакуолизации цитоплазмы. Регенерационную способность нейронов оценивали по формированию отростков в первые 24 ч культивирования. Все данные представлены как среднее из трех опытов, каждый из которых проведен в двух повторах. Значения представлены как среднее ± SE (n = 3). Статистический анализ был выполнен с использованием непарного t-теста Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Показано, что после инкубации мозга как без пептида (а), так и с пептидом Т8КУ (б) нейроны после высева в культуру способны не только сохранять жизнеспособность в течение 24 ч, но и
формировать отростки, характерные для данных нейронов (рис. 1).
После инкубации мозга при разных температурах в среде без пептида количество нейронов с отростками в культуре составило 66 ± 15% от общего количества живых клеток после инкубации при 22—24°С и 50 ± 23% при 4-6°С (рис. 2).
Инкубирование изолированного мозга моллюска с пептидом ТБКУ при температуре 22—24С. а) После предварительной инкубации мозга моллюска при температуре 22—24°С в растворе с различной концентрацией пептида Т8КУ доля живых нейронов при культивировании увеличивается по сравнению с контролем и в среднем составляет 172.2% при 1 х 10-5 М, 154.4% при 1 х х 10-6 М и 157.2% при 1 х 10-7 М (рис. 3а).
б) После предварительной инкубации мозга моллюска при температуре 22—24°С в растворе с различными концентрациями пептида Т8КУ доля нейронов с отростками через 24 ч культивирования снижалась по сравнению с контролем и в среднем составляла 30.8% при 1 х 10-5 М, 29.17% при 1 х 10-6 М и 13.3% при 1 х 10-7 М (рис. 4а).
Инкубирование изолированного мозга моллюска с пептидом ТБКУ при температуре 4—6°С. а) После предварительной инкубации мозга моллюска при пониженной температуре (4—6°С) в растворе с различными концентрациями пептида Т8КУ доля живых нейронов при культивировании значительно увеличивалась по сравнению с контролем и составляла 357.5% при 1 х 10-5 М, 322.5% при 1 х 10-6 М и 205% при 1 х 10-7 М (рис. 3б).
ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА ТЬг-Бег-ЬуБ-Туг
197
Рис. 2. Количество живых нейронов (1) и живых нейронов с отростками (2) после культивирования в течение 24 ч в КСНП. Предварительная инкубация изолированного мозга моллюска при 22—24°С (а) и 4—6°С (б) в течение 60 мин. * — значимые различия между числом живых нейронов и живых нейронов с отростками при различных температурах, р < 0.1.
0 10-5 10-6 10-7 0 10-5 10-6 10-7 Концентрация Т$КУ, М
Рис. 3. Количество живых нейронов (%) после культивирования в течение 24 ч. Предварительная инкубация мозга моллюска в растворе, содержащем Т8КУ в концентрации 1 х 10-5, 1 х 10-6 и 1 х 10 М при 22—24°С (а) и 4—6°С (б). *, **, *** _ разница между количеством живых нейронов в контроле и после инкубации с пептидом в различных концентрациях, р < 0.1,р < 0.025,р < 0.0001 соответственно.
б) Предварительная инкубация мозга моллюска при пониженной температуре (4—6°С) в растворе с различными концентрациями пептида Т8КУ не приводила к значимому изменению в формировании отростков нейронов в первые сутки культивирования, и доля клеток составляла 48% при 1 х 10-5 М, 24% при 1 х 10-6 М и 29% при 1 х 10-7 М (рис. 4б). Однако необходимо отметить, что тенденция к снижению формирования отростков сохранялась в данных условиях.
Показано, что после обработки мозга пептидом Т8КУ как при 22-24°С так и при 4-6°С общее число живых нейронов в культуре увеличива-
ется приблизительно в 1.5 и 3.5 раза по сравнению с контролем (рис. 3а, б). Эффект Т8КУ наиболее выражен после обработки мозга при пониженной температуре и при концентрации пептида, равной 10-5 М.
В то же время, количество нейронов, формирующих отростки в первые сутки культивирования после предварительной обработки пептидом Т8КУ в различных концентрациях, было достоверно ниже, чем в контроле при 22-24°С (рис. 4а), и без достоверных отличий между контрольными и опытными экспериментами после обработки
198
ИВЛИЧЕВА и др.
Рис. 4. Количество живых нейронов (%) с отростками после культивирования in vitro в течение 24 ч. Предварительная инкубация мозга моллюска в растворе при 22—24°С (а) и при 4—6°С (б) с TSKY в концентрации 1 х 10-5, 1 х 10 6 и 1 х 10-7 М. *, ** — разница между числом живых нейронов с отростками в контроле и после инкубации с пептидом в различных концентрациях,p < 0.05,p < 0.001 соответственно.
пептидом и инкубации при низкой температуре 4—6°С.
Таким образом, во-первых, мы можем отметить значительное увеличение общего числа живых клеток под влиянием пептида Т8КУ. Во-вторых, под действием пептида наблюдается снижение (рис. 4а), либо тенденция к снижению (рис. 4б), числа нейронов с отростками вне зависимости от температуры предварительной инкубации мозга с пептидом. Нам известно, что концентрация пептида Т8КУ в мозге зимоспящих животных, находящихся в состоянии спячки, приблизительно в 2 раза выше, чем в мозге активных животных, и этот пептид способен значительно снижать скорость сердечных сокращений у 36-часовых куриных эмбрионов [11]. Показано также, что охлаждение мышей, которым предварительно ввели пептид Т8КУ, индуцировало у животных длительную гипотермию [12]. Таким образом, если обратиться к полученным нами результатам, то можно предположить, что нервные клетки моллюска при обработке пе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.