научная статья по теме ВЛИЯНИЕ PH АДСОРБЦИОННЫХ БУФЕРОВ НА КОЛИЧЕСТВО И АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НА ПОВЕРХНОСТЬ ПОЛИСТИРОЛОВЫХ ПЛАНШЕТОВ Химия

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ PH АДСОРБЦИОННЫХ БУФЕРОВ НА КОЛИЧЕСТВО И АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НА ПОВЕРХНОСТЬ ПОЛИСТИРОЛОВЫХ ПЛАНШЕТОВ»

УДК 571.27

ВЛИЯНИЕ pH АДСОРБЦИОННЫХ БУФЕРОВ НА КОЛИЧЕСТВО И АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НА ПОВЕРХНОСТЬ ПОЛИСТИРОЛОВЫХ ПЛАНШЕТОВ

© 2015 г. Ю. Н. Тараканова*, А. Д. Дмитриев*, Ю. С. Массино*, А. А. Печелюлько*, О. Л. Сегал*, Ю. С. Скоблов**. Т. И. Уланова***, В. Ф. Лавров*, Д. А. Дмитриев*

*Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва, 105064 **Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, 117997 ***НПО "Диагностические системы", Нижний Новгород, 603034 e-mail: dmitrievda@mail.ru Поступила в редакцию 12.12.2014

Исследовали изменение концентрации и антигенсвязывающей активности 28 моноклональных антител после их адсорбции на поверхность планшетов из полистирола в буферах с различными значениями рН (1.0, 2.8, 7.5, 9.6 и 11.9). Использовали 16 клонов к белку р24 ВИЧ и 12 клонов к поверхностному антигену вируса гепатита В. Эффективность связывания адсорбированных антител с меченым антигеном оценивали по тангенсу угла наклона линейного участка кривой связывания с антигеном к оси концентраций. Показано, что 6 антител (21.5%) статистически достоверно увеличивали антигенсвязывающую активность после адсорбции при рН 2.8 и 11.9 по сравнению с рН 7.5 и 9.5. Установлено, что максимальное количество антител адсорбировалось на твердую фазу при рН 7.5. Анализ связывания 1251-ЫБ8-антигена с адсорбированными антителами позволил определить концентрацию активных антител на поверхности полистирола. Показано, что увеличение ан-тигенсвязывающей активности обусловлено повышением доли сохранивших активность антител после адсорбции при рН 2.8 и 11.9. В этих условиях антигенсвязывающую активность сохраняли около 20% антител по сравнению с 6% после иммобилизации при рН 7.5.

Ключевые слова: твердофазный иммуноферментный анализ, моноклональные антитела, рН адсорбции антител, аналитическая чувствительность, HBsAg.

DOI: 10.7868/S0555109915040157

Твердофазные иммуноферментные тест-системы для количественного определения антигенов, сконструированные по типу "сэндвич-методов", находят широкое применение в различных областях медицины, биотехнологической промышленности и в научных исследованиях. В современных вариантах твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) используются моноклональные антитела (МКА). При конструировании тест-систем в форме сэндвич-методов наиболее распространенным способом иммобилизации МКА является прямая их адсорбция на поверхность твердой фазы, что обусловлено ее простотой и дешевизной. Вместе с тем в ряде исследований показано, что более 90% МКА в результате адсорбции на поверхность планшетов из полистирола денатурируется, изменяя третичную и вторичную структуру и утрачивая способность связывать антиген [1, 2]. Следует отметить, что чувствительность анализа в таких системах существенно за-

висит от биологической (антигенсвязывающей) активности иммобилизованных антител.

Были предложены различные способы сохранения активности иммобилизованными МКА в таких системах, включающие создание промежуточных звеньев между поверхностью полистирола и МКА, которые защитили бы иммобилизованные молекулы антител от денатурации и обеспечили пространственную ориентацию, наиболее выгодную для распознавания и захвата антигена. В качестве такого звена могут быть использованы антивидовые антитела, прикрепляемые на твердую фазу в качестве первого слоя, стрептавидин-авидиновые мостики, промежуточные мостики из рекомбинантных белков, пришиваемых к МКА, а также различные МКА, ковалентно-при-соединенные к специально модифицированной поверхности полистирола для создания промежуточного слоя [1—5]. Вместе с тем остается актуальным изучение факторов, влияющих на наиболее простой и доступный метод иммобилизации анти-

тел, включающий пассивную адсорбцию МКА на твердую фазу.

К числу наиболее существенных факторов, влияющих на сохранение биологической активности антител, можно отнести состав и физико-химические свойства адсорбционных буферов. В ряде работ был проведен подробный анализ влияния рН на адсорбцию разнообразных антигенов (вирусных белков, липосахаридов и др.) для определения антител твердофазным ИФА [6—9]. Следует отметить, что данные о влиянии рН на антигенсвязывающие свойства адсорбированных антител весьма скудны. Были описаны поликлональные и моноклональ-ных антитела, для сохранения антигенсвязываю-щей активности которых требовалось использование буферов с низким или высоким значением рН. Так, в работе [10] при ИФА меченого антигена наблюдали увеличение активности поликлональных козьих антител, адсорбированных на планшете из полистирола при рН 5.0 (по сравнению с рН 7.5). Кроме того, известно, что встречаются МКА, которые сохраняют высокую антигенсвязывающую активность при конструировании сэндвич-методов после адсорбции при кислых или щелочных значениях рН [11]. Однако традиционно полагают, что оптимальными буферными системами для адсорбции антител на поверхность полистирола являются фосфатный и карбонатный буферы рН 7.5 и 9.5 соответственно.

В предыдущей работе МКА адсорбировали методом пассивной адсорбции на поверхность планшетов из полистирола в буферах с рН 2.8, 7.5 и 9.5 [12]. Оказалось, что около трети проанализированных МКА проявляли более высокую ан-тигенсвязывающую активность, если процесс их адсорбции на поверхность полистирола протекал в буфере с рН 2.8. Эксперименты с МКА, меченым флюоресцентным красителем, позволили подтвердить, что наблюдаемое увеличение связывания антител с антигеном было обусловлено повышением доли активных антигенсвязывающих сайтов и не сопровождалось возрастанием общего количества адсорбированных молекул [13].

Цель работы — провести количественную оценку с помощью 125I- меченых МКА к двум вирусным белкам (HBsAg и р24 ВИЧ) доли активных МКА по сравнению с общим количеством антител, иммобилизованных на планшетах из полистирола, используя адсорбционные буферы с пятью различными значениями рН (в диапазоне 1.0—11.9).

МЕТОДИКА

Использованные материалы. В исследовании использовали разборные 96-луночные планшеты из полистирола "MaxiSorp" и "MaxiSorp LockWell" фирмы "Nunc" (Дания), стретавидин-пе-роксидазу — "Biosource" (США), LC-LC-биотин —

"Pearce" (США) и другие реактивы — "Sigma" (США). Тетраметилбензидин (ТМБ), рекомби-нантный белок р24 ВИЧ1, экспрессированный в Escherichia coli (генотип 1а), и поверхностный антиген вируса гепатита В (HВsAg) серотипа ayw (S-по-липептид), экспрессированный в Pichiapastoris, были произведены НПО "Диагностические системы" (Россия).

Получение моноклональных антител. Мышиные МКА — продукты секреции различных гибридом-ных клеточных линий — были получены, как описано ранее [14, 15]. МКА очищали из асцитной жидкости до чистоты более 95% с помощью хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе [12, 16].

Биотинилирование белка р24 ВИЧ. Биотинили-рование проводили в соответствии с рекомендациями фирмы "Pearce". К 150 мкг белка Р24, растворенного в 1 мл 0.1 М гидрокарбонате натрия, добавляли 9 мкл (17.8 мкг) LC-LC-биотина, растворенного в диметилсульфоксиде (1.97 мг/мл). Молярное отношение белок р24^С^С-биотин в инкубационной смеси — 1 : 10. Реакцию проводили в ледяной бане 2 ч. Биотинилированный белок очищали на сефадексе G-25.

Приготовление конъюгата HBsAg с пероксида-зой хрена. HBsAg (1 мг) конъюгировали с перок-сидазой хрена (2 мг) по методу Накане [17]. Молярное отношение HBsAg/пероксидаза при конъюгации составляло ~1:1.

Адсорбция антител на поверхность планшетов.

Антитела адсорбировали на поверхность планшетов из полистирола (3 мкг/мл, 100 мкл на лунку) в течение 16—20 ч при комнатной температуре в следующих буферах: 0.1 М KCl-HCl-буфер, рН 1.0, 0.1 М глицин-НС1-буфер, рН 2.8, 0.025 М Na-фосфат-ный буфер, рН 7.5, 0.05 М Na-гидрокарбонатный буфер, рН 9.5 и 0.05 М Na2HPO4 - NaOH-буфер, рН 11.9. Планшеты отмывали пять раз (стандартная отмывка) 0.025 М Na-фосфатным буфером, рН 7.5, содержавшем 0.15 M NaCl (фосфатно-со-левой буфер, ФС) и 0.05% твина 20, и определяли антигенсвязывающую активность адсорбированных антител

Определение оптимального рН адсорбции тестируемых антител. Антитела адсорбировали на поверхность планшетов (8 мкг/мл, 100 мкл на лунку, 16-20 ч при комнатной температуре) в буферах, указанных выше, и определяли антигенсвязываю-щую активность адсорбированных антител.

Определение оптимальной концентрации антител в адсорбционных растворах при иммобилизации МКА на поверхность планшетов. Растворами тестируемых антител (1, 2, 3 и 6 мкг/мл) в буфере с оптимальным рН адсорбции насыщали полоски планшетов из полистирола (100 мкл/лунку) в течение ночи при комнатной температуре и определяли антигенсвязывающую активность.

Определение антигенсвязывающей активности иммобилизованных моноклональных антител. Для

оценки антигенсвязывающей активности иммобилизованных антител использовали ИБ8Л§, конъюгированный с пероксидазой хрена, и белок р24 ВИЧ, конъюгированный с биотином. Планшеты, насыщенные тестируемыми МКА, инкубировали (120 мин; 42°С для ИБ8Л§ и 37°С для белка р24 ВИЧ) с серийными разведениями (1— 64 нг/мл) меченых антигенов в 0.025 М №-фос-фатном буфере, рН 7.5, содержавшем 0.15 М №С1, 0.2% БСА и 0.05% твина 20 (ИФА-буфер). После инкубации с белком р24 ВИЧ, конъюгирован-ным с биотином, и стандартной отмывки в лунки добавляли по 100 мкл (50 нг/мл) стрептави-дин-пероксидазы, растворенной в ИФА-буфере, содержавшем вместо БСА 3% казеина. Активность пероксидазы, присутствующей в иммунных комплексах, определяли реакцией с ТМБ (100 мкл/лунку 15 мин при комнатной температуре), которую останавливали добавлением 50 мкл 0.5 М И2804. Содержание окрашенного продукта определяли по оптической плотности при 450 нм на сканере планшетов.

Приготовление антител и HBsAg, меченных 125Г

Антитела и ИБ8Л§ йодировали хлораминовым методом [18]. При йодировании антител инкубационная смесь содержала: 20 мкл 0.5 М №-фос-фатного буфера, рН 7.5, раствор антител (200 мкг) в 150—200 мкл 0.05 М ^-фосфатного буфера, рН 7.5, 10 мкл 1251 (5 мБк) и 20 мкл раствора хлорамина Т в воде (1 мг/мл). П

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком