УДК 582.28:579.222.3.083.1
ВЛИЯНИЕ pH, АЭРАЦИИ И ТЕМПЕРАТУРЫ НА СИНТЕЗ АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТЫ Mortierella alpina
© 2015 г. Э. Г. Дедюхина*, Т. И. Чистякова*, А. А. Миронов***, С. В. Камзолова*,
И. Г. Минкевич*, М. Б. Вайнштейн***
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Московской обл., 142290
e-mail: dedeg@rambler.ru
**Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино Московской обл., 142290
Поступила в редакцию 22.05.2014 г.
Изучено влияние рН, аэрации и температуры на рост гриба Mortierella alpna LPM-301, синтез липи-дов и арахидоновой кислоты на среде с глицерином. Установлено, что синтез арахидоновой кислоты в стационарной фазе роста микроорганизма существенно зависит от значения рН среды, оптимальный рост наблюдался при рН 6.0 и необратимо ингибировался при рН 3.0. Значение рО2 в пределах от 10 до 50% не оказывало существенного влияния на рост, синтез липидов и арахидоновой кислоты. Температурный оптимум для синтеза арахидоновой кислоты соответствовал 20—22°C. При проточном культивировании продуцента содержание арахидоновой кислоты достигало 29.8% от массы липидов и 7.4% от биомассы. Содержание арахидоновой кислоты от потребленного глицерина составляло 4.1% по массе и 8.8% по энергии. Высказано предположение, что синтез арахидоновой кислоты лимитировался при неблагоприятных значениях рН активностью Д-12-десатуразы, а при повышенных температурах — превращением линолевой кислоты в арахидоновую.
Ключевые слова: арахидоновая кислота, биосинтез, Mortierella alpna. DOI: 10.7868/S055510991502004X
Арахидоновая кислота (5,8,11,14-цис-эйкоза-тетраеновая кислота, АК) относится к ю-6 типу полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) и, благодаря своим уникальным биологическим свойствам, находит широкое применение в медицине, в сельском хозяйстве в качестве стимулятора иммунитета растений к фитопатогенам и пищевой промышленности, являясь необходимым компонентом в диетпитании и питательных смесей для грудных детей [1—6]. Необходимость развития микробиологического производства АК с использованием высокоэффективных штаммов-продуцентов и дешевых возобновляемых углеродных субстратов связана с ограниченностью ее природных источников (печень и надпочечная железа животных, желток куриных яиц).
Ранее был разработан микробиологический метод селекции штаммов микромицетов-проду-центов АК, основанный на использовании ацетилсалициловой кислоты в качестве ингибитора ее метаболизма [7]. Были выделены штаммы Mortierella alpina, активные продуценты АК [8] и исследован ее синтез селекционированными штаммами в условиях периодического и непрерывного культивирования на среде с глюкозой [9, 10]. Показано, что на основании расчета материально -энергетического баланса роста микроорганизмов
можно оценить эффективность микробиологических процессов при использовании различных по энергосодержанию углеродных субстратов [11]. Установлена прямая корреляция между содержанием липидов, элементным составом и энергосодержанием биомассы микроорганизмов [12].
В последние годы в качестве перспективного, дешевого и возобновляемого субстрата для микробиологических процессов используется глицерин [13-17]. Очищенный глицерин производится нефтехимическим синтезом, в то время, как неочищенный глицерин образуется в качестве отходов при производстве биодизельного топлива [18]. Была показана возможность синтеза АК микро-мицетами рода Mortierella при росте на средах с очищенным глицерином в условиях глубинного культивирования [19, 20] и при твердофазной ферментации на овсяной крупе при добавлении 1-4% глицерина [21, 22]. Было установлено, что селекционированные штаммы M. alpina способны использовать глицеринсодержащие отходы производства биодизеля в качестве единственного источника углерода и энергии и синтезировать значительное количество АК [23].
Из литературных данных следует, что наибольшее влияние на синтез ненасыщенных жирных кислот у микроорганизмов оказывает температу-
ра [3, 24—30]. Считается, что повышение степени ненасыщенности жирных кислот мембран является адаптивной реакцией микроорганизмов на понижение температуры окружающей среды [31]. Поскольку реакции десатурации жирных кислот требуют присутствия молекулярного кислорода, можно предположить, что степень аэрации также должна оказывать существенное влияние на синтез ненасыщенных жирных кислот у микроорганизмов [24, 32, 33]. Известно, что рН среды, как правило, не оказывает существенного влияния на синтез липидов у эукариотических микроорганизмов [3, 30]. Имеются единичные сведения об увеличении синтеза ПНЖК у M. ramanniana var. angulispora при повышении рН [34]. Данные о влиянии рН на синтез АК у мицелиальных грибов в литературе отсутствуют.
Цель работы — исследование влияния физических факторов (рН, аэрации и температуры) на рост, содержание липидов и синтез АК у ранее селекционированного и перспективного для промышленности штамма—продуцента АК M. alpina LPM-301 в условиях периодического и непрерывного культивирования на среде, содержащей очищенный глицерин в качестве углеродного субстрата.
МЕТОДИКА
В работе использовали штамм M. alpina LPM-301, который был ранее селекционирован в качестве активного продуцента АК [10].
Влияние рН на синтез АК исследовали в условиях периодического культивирования продуцента в колбах (750 мл) на среде следующего состава (г/л): KNO3, - 1.5; K2HPO4, - 1.5; KH2PO4 -0.7; MgSO4 • 7H2O - 0.15; CaCl2 • 6H2O - 0.12; дрожжевой экстракт "Difco" (США) - 5.0; микроэлементы (мг/л): FeSO4 • 7H2O - 14.9; MnSO4 •
• 4H2O - 0.2; ZnSO4 • 7H2O - 8.1; CuSO4 • 5H2O - 3.9. Начальная концентрация глицерина в среде составляла 30 г/л, по мере потребления его вносили дополнительно. Культивирование проводили на качалке (180-200 об/мин) при 28°C. Постоянное значение рН в процессе культивирования поддерживали внесением 5%-ной H2SO4. Грибы выращивали при рН 6.0 в течение 7 сут, затем доводили рН до значений: 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, и продолжали культивирование еще 7 сут.
Влияние аэрации на рост M. alpina LPM-301, синтез липидов и АК исследовали в условиях периодического культивирования в 10-л ферментере АНКУМ-2М (Россия) с рабочим объемом 7 л на среде, содержащей (г/л): глицерин - 40, KNO3 - 1.5, KH2PO4 - 2.0, MgSO4 • 7H2O - 0.15, CaCl2 • 6H2O - 0.12, дрожжевой экстракт "Difco" (США) - 5.0 и микроэлементы (мг/л): FeSO4 •
• 7H2O - 14.9; MnSO4 • 4H2O - 0.2, ZnSO4 • 7H2O -
8.1 и CuSO4 • 5H2O - 3.9. В процессе культивирования рН (6.0 ± 0.1) поддерживали автоматически добавлением 5%-ной H2SO4, температуру устанавливали на уровне 28 ± 0.1°C. Концентрацию растворенного кислорода (рО2: 5, 10 и 50% от насыщения) регулировали изменением скорости подачи воздуха в ферментер. Во избежание повреждения мицелия скорость перемешивания не превышала 400 об/мин.
Влияние температуры на рост грибов, синтез липидов и АК исследовали в условиях непрерывного культивирования продуцента в тех же условиях. Среду подавали в ферментер со скоростью 40 мл/ч. Культуральную жидкость (1 л) отбирали, когда объем среды в ферментере достигал 7 л. Скорость разбавления и, соответственно, удельная скорость роста в течение цикла между отборами проб изменялась от 0.0067 до 0.0057 ч-1. Культуру выращивали в периодическом режиме при температуре 28°C в течение 3 сут, затем включали проток среды. Достижение стационарного состояния роста культуры определяли по установлению постоянной концентрации остаточного глицерина. Значения рН (6.0 ± 0.1) и рО2 (20-50% от насыщения) поддерживали автоматически.
Биомассу определяли после фильтрования культуральной жидкости через бумажный фильтр и высушивания мицелия при 105°C до постоянного веса. Содержание глицерина оценивали методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) на хроматографе Chrom-5 (Чехия) в изотермическом режиме (200°C) на колонке (200 X 0.3 см) с сорбентом Reoplex-400 (15%), нанесенным на Chro-maton N-AW (0.16-0.20 мм). В качестве газа-носителя использовали аргон. Концентрацию глицерина рассчитывали, используя калибровочную кривую.
Для определения жирнокислотного состава липидов биомассу высушивали под вакуумом при 70°C до постоянного веса и подвергали кислотному метанолизу [35]. Метиловые эфиры жирных кислот анализировали методом ГЖХ и идентифицировали, используя стандартные смеси ("Serva", Германия). Условия ГЖХ были такими же, как при определении содержания глицерина. Содержание липидов рассчитывали как сумму жирных кислот. В качестве внутреннего стандарта использовали гептадекановую кислоту.
Выход биомассы от потребленного глицерина по массе (Yx/S, %) рассчитывали по формуле:
Yx/S = (X/S) х 100,
где x - биомасса, г/л; S - потребленный глицерин, г/л.
Выход липидов от потребленного глицерина по массе (YL/S, %) рассчитывали по формуле:
Yl/s = (L/S) х 100,
Таблица 1. Влияние рН на выход биомассы, содержание липидов и арахидоновой кислоты в стационарной фазе роста M. alpina LPM-301
Показатель рН
3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0
Биомасса, г/л 13.3 16.6 18.7 18.8 20.2 21.2
Выход мицелия по массе, % (Ух/ь) 28.7 25.5 25.5 25.9 24.3 26.2
Энергосодержание биомассы (0в) 20.3 22.6 24.7 24.9 24.7 21.2
Выход биомассы по энергии, % (Цх/ь) 32.5 32.1 35.2 35.9 33.4 31.0
Липиды, % от биомассы 18.7 26.7 34.4 35.0 34.2 21.9
Липиды, г/л 2.5 4.4 6.4 6.6 6.9 4.6
Выход липидов по массе, % (У^ц) 5.4 6.8 8.8 9.1 8.3 5.7
Выход липидов по энергии, % (Цц$) 12.8 16.1 20.8 21.5 19.7 13.5
АК, г/л 0 0.5 1.4 1.8 1.7 1.1
АК, % от биомассы 0 2.9 7.5 9.6 8.6 5.1
Выход АК по массе, % (Ук/б) 0 0.7 1.9 2.5 2.1 1.3
Выход АК по энергии, % (Цак/ь) 0 1.6 4.1 5.3 4.5 2.9
где L — липиды, г/л; S — потребленный глицерин, г/л.
Выход биомассы от потребленного глицерина по энергии (nX/S, %) рассчитывали по формуле:
пх/s = (Qв/Qs)Yx/s, где QB — энергосодержание биомассы, кДж/г; QS — энергосодержание глицерина, кДж/г. Энергосодержание глицерина (QS) принято равным 17.96 кДж/г [11].
Энергосодержание биомассы (QB, кДж/г) рассчитывали по формуле [12]:
Qb = 15.1 + 0.28/l, где fL — содержание липидов в биомассе, %.
Выход липидов от потребленного глицерина
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.