УДК 578.233,577.322
ВЛИЯНИЕ pH НА ХАРАКТЕР АДСОРБЦИИ МАТРИКСНОГО
ВИРУСНОГО БЕЛКА М1 © 2015 г. В. В. Бревнов1, Н. В. Федорова3, А. В. Инденбом12*
Московский физико-технический институт (государственный университет), 141700, Московская область, Долгопрудный, Институтский пер., 9; *электронная почта: a.indenbom@gmail.com 2Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, 119071, Москва, Ленинский просп., 31, стр. 4 3Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119992, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 40
Поступила в редакцию 20.10.2014 г.
Методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) исследована адсорбция матриксного вирусного белка М1 на подложке, моделирующей поверхность липидной мембраны вируса гриппа. Установлено, что снижение рН ведет к увеличению времени достижения уровня насыщения адсорбции, несмотря на рост ее начальной скорости. Адсорбция М1 необратима в кислой и нейтральных средах, но в первом случае уровень насыщения адсорбции существенно зависит от концентрации белка. Несмотря на необратимость адсорбции при всех значениях рН закисление раствора до рН 4 приводило к частичной десорбция белка из слоя, сформированного при рН 7. На основании полученных данных сделано предположение о рН-индуцированных изменениях формы адсорбированных молекул М1. В кислой среде вытянутые молекулы белка адсорбируются преимущественно латерально в разбавленных растворах и в большей степени ортогонально в концентрированных растворах. В нейтральной среде молекулы белка приобретают компактную конформацию в адсорбционном слое и его толщина не зависит от концентрации. По-видимому, основную роль в рН-индуци-рованном изменении формы адсорбированного белка играет его подвижный С-концевой домен.
Ключевые слова: вирус гриппа А, вирусный матриксный белок М1, поверхностный плазмонный резонанс.
Б01: 10.7868/80233475515020048
ВВЕДЕНИЕ
Вирус гриппа — это оболочечный вирус диаметром от 80 до 140 нм [1]. Внешняя его часть образована липидным бислоем с встроенными в него трансмембранными белками. С внутренней стороны к липидному бислою примыкает матриксный каркас из белка М1, ассоциированный с расположенным внутри вириона рибонуклеопро-теином (РНП) [2—4]. Матриксный белок играет ключевую роль в ходе сборки и баддинга дочерних вирионов [5—7]. Склонность М1 к олигоме-ризации в нейтральной среде [8] определяет высокую плотность белковой сети [9], которая не позволяет выйти из вириона достаточно крупным частицам РНП [10, 11]. Если в нейтральной среде белковый каркас предохраняет генетический материал вируса от воздействия внешних факторов, то при закислении внутриэндосомальной среды до рН 5 и ниже, постепенно происходящем при движении вируса в направлении клеточного ядра, матриксный каркас теряет свою целостность,
позволяя генетическому материалу вируса выйти в цитоплазму клетки [2, 3, 12, 13].
Структура матриксного белка в значительной степени определяет специфику его взаимодействия с липидным бислоем. На данный момент известно, что М1 представляет собой небольшую молекулу массой 27.8 кДа, состоящую из 252 аминокислотных остатков (а.о.) [9, 14], в которой выделяют три домена: N (2—67 а.о.), М (91—158 а.о.) и С (165—252 а.о.) [2]. Структура белка М1 в целом до сих пор не установлена, так как при всех попытках его кристаллизации происходило отщепление С-концевого домена [2, 15]. Известно, что ^концевая часть белка имеет форму правильной глобулы [14, 16], а молекула М1 белка в целом имеет вытянутую структуру, главным образом благодаря С-домену [14]. Согласно данным кругового дихроизма, малоуглового нейтронного рассеяния, тритиевой планиграфии и малоуглового рентгеновского рассеяния, полученным в кислой среде [14, 16, 17], этот домен, в отличие от ^концевой части, обладает менее упорядочен-
ной и подвижной структурой. Конформация молекулы М1 в растворе и на поверхности липидной оболочки вируса может существенно отличаться. Так, согласно оценкам, полученным методами малоуглового нейтронного и рентгеновского рассеяния [14, 17], длина молекулы М1 оценивается в 8—10 нм, в то время как данные электронной микроскопии свидетельствуют о том, что в белковом слое на поверхности вириона размер этих молекул не превышает 6 нм [9, 18]. Последнее значение в точности соответствует оцененному в [17] размеру молекулы белка с наиболее компактно уложенным С-концевым доменом.
До сих пор остается неясным, какие взаимодействия являются ключевыми при связывании белка с липидным бислоем в вирионе. Известно, что в белке М1 127 из 252 а.о. гидрофобные (ала-нин, глицин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, триптофан, валин, метионин, пролин и цистеин) [19]. Это позволяет белку вступать в гидрофобные взаимодействия с мембраной. Тот факт, что в нейтральной среде М1 в целом заряжен положительно (48 а.о. несут положительный заряд, а 23 — отрицательный), позволяет предположить, что электростатические силы играют большую роль при его взаимодействии с липидным бислоем. Действительно, в ряде работ [9, 20—22] говорится о первостепенной роли таких сил, возникающих между положительно заряженными группами М1 и отрицательно заряженной поверхностью липидной мембраны.
На взаимодействие белка М1 с липидным бис-лоем существенное влияние оказывает изменение рН. Известно, что при попадании вируса в кислую среду происходит отщепление молекул РНП от М1 [3, 23]. Недавно методом криоэлек-тронной микроскопии было обнаружено, что спустя несколько минут после понижения рН уменьшается толщина белкового слоя. Авторы связывают это явление с изменением конформа-ции молекулы М1 [18]. К аналогичному выводу мы пришли ранее при исследовании особенностей адсорбции М1 в кислой среде [24]. На основании полученных данных было выдвинуто предположение, что благодаря слабоупорядоченной структуре (прежде всего С-концевого домена) и сильному взаимодействию с поверхностью, моделирующей липидный бислой, М1 распластывается на ней. Однако в указанной работе, выполненной при рН 4, не изучалось поведение белка М1 при других значениях рН и изменение белкового слоя, сформированного в нейтральной среде, в результате закисления раствора. Именно этот процесс играет одну из ключевых ролей при инфицировании вирусом. В связи с этим целью данной работы было исследование влияния кислотности среды и ее изменения на особенности адсорбции белка М1 на подложке, моделирующей поверхность клеточной мембраны.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Реактивы. В экспериментах использовали следующие реактивы: KCl (х. ч. Реахим, Россия), MES (Calbiochem, США, чистота >99%), меркап-тогексадекановая кислота (16-mercaptohexade-canoic acid, 99%, Aldrich, США), HCl (х. ч. Реахим, Россия), KOH (х. ч. Реахим, Россия), хлороформ (х. ч. Реахим, Россия), н-гексан (о. с.ч., Реахим, Россия). Все растворы готовили на основе деионизованной воды.
Приготовление белка М1. Матриксный белок М1 получчали из вирионов гриппа штамма A/PR/8/34 методом Жирнова [25]. Его выделяли путем кислотной солюбилизации мембраны вируса гриппа неионным детергентом NP-40 (Igepal СА-630) в буферном растворе с рН 4.0, содержащем 50 мМ MES и 100 мМ NaCl, как описано ранее [24]. В экспериментах использовали растворы белка, содержащие 100 мМ KCl и 2 мМ MES с необходимым рН.
Метод поверхностного плазмонного резонанса
(ППР). Адсорбцию белка изучали на ППР-ре-фрактометре "Biosuplar 6" (Mivitec, Германия) [24], позволяющем регистрировать кинетику адсорбции в реальном масштабе времени. К позолоченной поверхности чипа прикрепляли плоскую (примерно 1 х 0.5 х 0.1 см3) двухкамерную проточную термостатируемую ячейку. Через нее с помощью перистальтического насоса (MasterFlex C/L, Barland Co., США) прокачивали исследуемые растворы. Появление на поверхности сенсора молекул белка сопровождалось изменением оптических параметров поверхностного слоя. Поверхностный плазмонный резонанс обладает чрезвычайно высокой чувствительностью к таким изменениям. Увеличение показателя преломления тонкого приповерхностного слоя в результате адсорбции регистрировали по росту сигнала ППР-рефрактометра, измеряемому в условных единицах. Изменение этого сигнала пропорционально росту поверхностной концентрации белка.
Все измерения проводили при комнатной температуре (24 ± 1°C).
Приготовление тиолизированных подложек.
Для исследования адсорбции белка использовали чипы, представляющие собой стеклянные пластинки с напыленным через промежуточный адгезивный слой хрома (1—1.5 нм) слоем золота (50 нм). Для создания системы, моделирующей липидный бислой оболочки вируса, на поверхность золота наносили слой молекул меркаптогек-садекановой кислоты, который в нейтральной среде обеспечивал отрицательный заряд его поверхности, подобно заряженным головкам липидов в оболочке вируса. Перед нанесением покрытий позолоченные пластинки проходили несколько стадий очистки. Сначала их мыли хлороформом, затем в течение 10—20 с в ультразвуковой ванне (ПСБ-Галс, Россия) с этанолом (96%). Далее про-
щества в гексане (ос. ч., не менее 99.85 мас. %, Ре-ахим, Россия) в течение 30 мин при температуре 50°С, а затем оставляли в том же растворе на ночь при комнатной температуре. По окончании этой процедуры пластинки трехкратно промывали гексаном и высушивали в атмосфере аргона в течение 10 мин.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние рН на кинетику адсорбции. Для определения влияния кислотности среды на сродство белка к подложке мы исследовали зависимость начальной скорости адсорбции от рН среды при постоянной концентрации белка в растворе (250 нМ). Оказалось, что в интервале рН от 4 до 7 эта скорость монотонно уменьшалась более чем в 1.5 раза (рис. 1), причем наиболее резко — в области низких значений рН. Полученная зависимость, по-видимому, отражает ослабление взаимодействий белка с поверхностью по мере уменьшения кислотности раствора, что может быть вызвано снижением заряда М1. Подробно влияние рН на кинетические кривые адсорбции описано далее для двух значений рН — 7 и 4.
При введении белка в концентрации 250 нМ в мывали дистиллированной водой и сушили при проточ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.