научная статья по теме ВЛИЯНИЕ PH НА ХАРАКТЕР АДСОРБЦИИ МАТРИКСНОГО ВИРУСНОГО БЕЛКА М1 Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ PH НА ХАРАКТЕР АДСОРБЦИИ МАТРИКСНОГО ВИРУСНОГО БЕЛКА М1»

УДК 578.233,577.322

ВЛИЯНИЕ pH НА ХАРАКТЕР АДСОРБЦИИ МАТРИКСНОГО

ВИРУСНОГО БЕЛКА М1 © 2015 г. В. В. Бревнов1, Н. В. Федорова3, А. В. Инденбом12*

Московский физико-технический институт (государственный университет), 141700, Московская область, Долгопрудный, Институтский пер., 9; *электронная почта: a.indenbom@gmail.com 2Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, 119071, Москва, Ленинский просп., 31, стр. 4 3Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119992, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 40

Поступила в редакцию 20.10.2014 г.

Методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) исследована адсорбция матриксного вирусного белка М1 на подложке, моделирующей поверхность липидной мембраны вируса гриппа. Установлено, что снижение рН ведет к увеличению времени достижения уровня насыщения адсорбции, несмотря на рост ее начальной скорости. Адсорбция М1 необратима в кислой и нейтральных средах, но в первом случае уровень насыщения адсорбции существенно зависит от концентрации белка. Несмотря на необратимость адсорбции при всех значениях рН закисление раствора до рН 4 приводило к частичной десорбция белка из слоя, сформированного при рН 7. На основании полученных данных сделано предположение о рН-индуцированных изменениях формы адсорбированных молекул М1. В кислой среде вытянутые молекулы белка адсорбируются преимущественно латерально в разбавленных растворах и в большей степени ортогонально в концентрированных растворах. В нейтральной среде молекулы белка приобретают компактную конформацию в адсорбционном слое и его толщина не зависит от концентрации. По-видимому, основную роль в рН-индуци-рованном изменении формы адсорбированного белка играет его подвижный С-концевой домен.

Ключевые слова: вирус гриппа А, вирусный матриксный белок М1, поверхностный плазмонный резонанс.

Б01: 10.7868/80233475515020048

ВВЕДЕНИЕ

Вирус гриппа — это оболочечный вирус диаметром от 80 до 140 нм [1]. Внешняя его часть образована липидным бислоем с встроенными в него трансмембранными белками. С внутренней стороны к липидному бислою примыкает матриксный каркас из белка М1, ассоциированный с расположенным внутри вириона рибонуклеопро-теином (РНП) [2—4]. Матриксный белок играет ключевую роль в ходе сборки и баддинга дочерних вирионов [5—7]. Склонность М1 к олигоме-ризации в нейтральной среде [8] определяет высокую плотность белковой сети [9], которая не позволяет выйти из вириона достаточно крупным частицам РНП [10, 11]. Если в нейтральной среде белковый каркас предохраняет генетический материал вируса от воздействия внешних факторов, то при закислении внутриэндосомальной среды до рН 5 и ниже, постепенно происходящем при движении вируса в направлении клеточного ядра, матриксный каркас теряет свою целостность,

позволяя генетическому материалу вируса выйти в цитоплазму клетки [2, 3, 12, 13].

Структура матриксного белка в значительной степени определяет специфику его взаимодействия с липидным бислоем. На данный момент известно, что М1 представляет собой небольшую молекулу массой 27.8 кДа, состоящую из 252 аминокислотных остатков (а.о.) [9, 14], в которой выделяют три домена: N (2—67 а.о.), М (91—158 а.о.) и С (165—252 а.о.) [2]. Структура белка М1 в целом до сих пор не установлена, так как при всех попытках его кристаллизации происходило отщепление С-концевого домена [2, 15]. Известно, что ^концевая часть белка имеет форму правильной глобулы [14, 16], а молекула М1 белка в целом имеет вытянутую структуру, главным образом благодаря С-домену [14]. Согласно данным кругового дихроизма, малоуглового нейтронного рассеяния, тритиевой планиграфии и малоуглового рентгеновского рассеяния, полученным в кислой среде [14, 16, 17], этот домен, в отличие от ^концевой части, обладает менее упорядочен-

ной и подвижной структурой. Конформация молекулы М1 в растворе и на поверхности липидной оболочки вируса может существенно отличаться. Так, согласно оценкам, полученным методами малоуглового нейтронного и рентгеновского рассеяния [14, 17], длина молекулы М1 оценивается в 8—10 нм, в то время как данные электронной микроскопии свидетельствуют о том, что в белковом слое на поверхности вириона размер этих молекул не превышает 6 нм [9, 18]. Последнее значение в точности соответствует оцененному в [17] размеру молекулы белка с наиболее компактно уложенным С-концевым доменом.

До сих пор остается неясным, какие взаимодействия являются ключевыми при связывании белка с липидным бислоем в вирионе. Известно, что в белке М1 127 из 252 а.о. гидрофобные (ала-нин, глицин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, триптофан, валин, метионин, пролин и цистеин) [19]. Это позволяет белку вступать в гидрофобные взаимодействия с мембраной. Тот факт, что в нейтральной среде М1 в целом заряжен положительно (48 а.о. несут положительный заряд, а 23 — отрицательный), позволяет предположить, что электростатические силы играют большую роль при его взаимодействии с липидным бислоем. Действительно, в ряде работ [9, 20—22] говорится о первостепенной роли таких сил, возникающих между положительно заряженными группами М1 и отрицательно заряженной поверхностью липидной мембраны.

На взаимодействие белка М1 с липидным бис-лоем существенное влияние оказывает изменение рН. Известно, что при попадании вируса в кислую среду происходит отщепление молекул РНП от М1 [3, 23]. Недавно методом криоэлек-тронной микроскопии было обнаружено, что спустя несколько минут после понижения рН уменьшается толщина белкового слоя. Авторы связывают это явление с изменением конформа-ции молекулы М1 [18]. К аналогичному выводу мы пришли ранее при исследовании особенностей адсорбции М1 в кислой среде [24]. На основании полученных данных было выдвинуто предположение, что благодаря слабоупорядоченной структуре (прежде всего С-концевого домена) и сильному взаимодействию с поверхностью, моделирующей липидный бислой, М1 распластывается на ней. Однако в указанной работе, выполненной при рН 4, не изучалось поведение белка М1 при других значениях рН и изменение белкового слоя, сформированного в нейтральной среде, в результате закисления раствора. Именно этот процесс играет одну из ключевых ролей при инфицировании вирусом. В связи с этим целью данной работы было исследование влияния кислотности среды и ее изменения на особенности адсорбции белка М1 на подложке, моделирующей поверхность клеточной мембраны.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реактивы. В экспериментах использовали следующие реактивы: KCl (х. ч. Реахим, Россия), MES (Calbiochem, США, чистота >99%), меркап-тогексадекановая кислота (16-mercaptohexade-canoic acid, 99%, Aldrich, США), HCl (х. ч. Реахим, Россия), KOH (х. ч. Реахим, Россия), хлороформ (х. ч. Реахим, Россия), н-гексан (о. с.ч., Реахим, Россия). Все растворы готовили на основе деионизованной воды.

Приготовление белка М1. Матриксный белок М1 получчали из вирионов гриппа штамма A/PR/8/34 методом Жирнова [25]. Его выделяли путем кислотной солюбилизации мембраны вируса гриппа неионным детергентом NP-40 (Igepal СА-630) в буферном растворе с рН 4.0, содержащем 50 мМ MES и 100 мМ NaCl, как описано ранее [24]. В экспериментах использовали растворы белка, содержащие 100 мМ KCl и 2 мМ MES с необходимым рН.

Метод поверхностного плазмонного резонанса

(ППР). Адсорбцию белка изучали на ППР-ре-фрактометре "Biosuplar 6" (Mivitec, Германия) [24], позволяющем регистрировать кинетику адсорбции в реальном масштабе времени. К позолоченной поверхности чипа прикрепляли плоскую (примерно 1 х 0.5 х 0.1 см3) двухкамерную проточную термостатируемую ячейку. Через нее с помощью перистальтического насоса (MasterFlex C/L, Barland Co., США) прокачивали исследуемые растворы. Появление на поверхности сенсора молекул белка сопровождалось изменением оптических параметров поверхностного слоя. Поверхностный плазмонный резонанс обладает чрезвычайно высокой чувствительностью к таким изменениям. Увеличение показателя преломления тонкого приповерхностного слоя в результате адсорбции регистрировали по росту сигнала ППР-рефрактометра, измеряемому в условных единицах. Изменение этого сигнала пропорционально росту поверхностной концентрации белка.

Все измерения проводили при комнатной температуре (24 ± 1°C).

Приготовление тиолизированных подложек.

Для исследования адсорбции белка использовали чипы, представляющие собой стеклянные пластинки с напыленным через промежуточный адгезивный слой хрома (1—1.5 нм) слоем золота (50 нм). Для создания системы, моделирующей липидный бислой оболочки вируса, на поверхность золота наносили слой молекул меркаптогек-садекановой кислоты, который в нейтральной среде обеспечивал отрицательный заряд его поверхности, подобно заряженным головкам липидов в оболочке вируса. Перед нанесением покрытий позолоченные пластинки проходили несколько стадий очистки. Сначала их мыли хлороформом, затем в течение 10—20 с в ультразвуковой ванне (ПСБ-Галс, Россия) с этанолом (96%). Далее про-

щества в гексане (ос. ч., не менее 99.85 мас. %, Ре-ахим, Россия) в течение 30 мин при температуре 50°С, а затем оставляли в том же растворе на ночь при комнатной температуре. По окончании этой процедуры пластинки трехкратно промывали гексаном и высушивали в атмосфере аргона в течение 10 мин.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние рН на кинетику адсорбции. Для определения влияния кислотности среды на сродство белка к подложке мы исследовали зависимость начальной скорости адсорбции от рН среды при постоянной концентрации белка в растворе (250 нМ). Оказалось, что в интервале рН от 4 до 7 эта скорость монотонно уменьшалась более чем в 1.5 раза (рис. 1), причем наиболее резко — в области низких значений рН. Полученная зависимость, по-видимому, отражает ослабление взаимодействий белка с поверхностью по мере уменьшения кислотности раствора, что может быть вызвано снижением заряда М1. Подробно влияние рН на кинетические кривые адсорбции описано далее для двух значений рН — 7 и 4.

При введении белка в концентрации 250 нМ в мывали дистиллированной водой и сушили при проточ

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»