БИОЛОГИЯ ВНУТРЕННИХ ВОД, 2015, № 2, с. 85-90
ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ ГИДРОБИОНТОВ
УДК 592-113.2+597-153
ВЛИЯНИЕ рН НА АКТИВНОСТЬ ГЛИКОЗИДАЗ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ -ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ ПИТАНИЯ ПЛАНКТО-И БЕНТОСОЯДНЫХ РЫБ В УСЛОВИЯХ in vitro
© 2015 г. В. В. Кузьмина*, Г. В. Золотарева**, В. А. Шептицкий**
*Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, 152742 пос. Борок, Ярославская обл., Некоузский р-н, e-mail: vkuzmina@ibiw.yaroslavl.ru **Приднестровский государственный университет им. Т.Г. Шевченко, Тирасполь, PO Box 3300, Молдова Поступила в редакцию 02.09.2013 г.
Показано, что общая амилолитическая активность относящихся к разным таксономическим группам потенциальных объектов питания планкто- и бентосоядных рыб и сопутствующей микробиоты значительно зависит от рН среды. Максимальная активность гликозидаз у всех видов беспозвоночных и микробиоты, выделенной из их организма, проявляется при рН 7.0, минимальная — при 10.0. Микробиота дрейссены и рачкового планктона может эффективно деполимеризовать полисахариды в зоне кислых значений рН.
Ключевые слова: объекты питания рыб, планктофаги, бентофаги, микробиота, беспозвоночные, гликозидазы, общая амилолитическая активность, рН.
Б01: 10.7868/80320965215020102
ВВЕДЕНИЕ
Ферменты объектов питания животных участвуют в деградации различных компонентов собственных тканей за счет механизма индуцированного аутолиза, а гидролазы энтеральной микробиоты осуществляют симбионтное пищеварение [21]. Позднее доказали, что гидролазы объектов питания [14, 15] и энтеральной микробиоты [10, 11, 15, 16, 19, 24] играют значительную роль в процессах пищеварения рыб. При этом наибольшее внимание уделялось протеиназам потенциальных жертв ихтиофагов, поскольку индуцированный аутолиз наиболее эффективен в кислой среде желудка [15].
В цикле работ по изучению влияния природных и антропогенных факторов на активность ферментов рыб и их потенциальных объектов питания установлено значительное влияние температуры и рН на активность как протеиназ [12, 17, 18], так и гликозидаз [3, 4, 15]. При этом определения, как правило, проводились лишь при нескольких значениях рН. В работе [28] по изучению рН-зависи-мости протеиназ слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты у ихтиофагов показано, что максимумы активности исследованных препаратов не всегда совпадают. При этом наиболее существенно различались характеристики протеиназ энтеральной микробиоты. Если максимум активности протеиназ слизи-
стой оболочки кишечника и химуса наблюдался при рН 10, то энтеральной микробиоты — в зоне щелочных, нейтральных и даже кислых значений рН [7, 28].
Активность протеиназ и гликозидаз пищеварительного тракта в значительной мере зависит от спектра питания и биохимического состава пищи рыб, причем активность последних у планкто- и бентофагов выше, чем у ихтиофагов [23, 25, 27]. У различных видов потенциальных объектов питания планкто- и бентофагов активность протеаз также значительно ниже таковой гликозидаз [6, 23]. Вместе с тем на активность гидролаз беспозвоночных — объектов питания планкто- и бентофагов, значительное влияние оказывают ферменты микроорганизмов, присутствующих на поверхности тела, а также в различных органах и тканях [15, 16]. Наиболее подробно изучена микробиота пищеварительной системы у пресноводных двустворчатых моллюсков. В кишечнике унионид выявлена микробиота, обладающая амилолитической активностью [24]. Сведения о рН-зависимости гликозидаз потенциальных объектов питания планто- и бентофагов, а также сопутствующей микробиоты в доступной литературе отсутствуют.
Цель работы — изучение влияния рН на общую амилолитическую активность у ряда видов беспозвоночных животных, доминирующих в пище
рыб, относящихся по типу питания к планкто- и бентофагам, а также микробиоты, сопутствующей объектам питания.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа проведена летом 2013 г. Объекты исследования — рачковый зоопланктон (суммарные пробы, включающие представителей Dafnii-formes, Copepoda и Ostracoda), бокоплав Am-phipoda sp., личинки хирономид Chironomus sp., олигохеты Oligohaeta sp. и дрейссена Dreissena polymorpha (Pall.), собранные в Кучурганском водохранилище.
В качестве ферментативно-активных препаратов использовали гомогенаты целого организма беспозвоночных животных и культуры микро-биоты, выделенной из их организма. Количество животных варьировало от нескольких десятков до нескольких сотен (зоопланктон). Моллюсков (7—10 экз.) исследовали без раковины. Особей одного вида или одной таксономической группы в стерильных условиях объединяли, измельчали, тщательно перемешивали и формировали одну пробу. Затем отбирали требуемое количество материала (2—3 г) для приготовления исходного го-могената. Навески тканей растирали в стерильных фарфоровых ступках на ледяной бане при температуре 0—4°С. При сборе микробиологического материала руководствовались методиками из работ [29, 30]. Из полученной средней пробы отбирали 1 мл гомогенизированных тканей и готовили разведения в стерильной посуде до 1 : 103 с использованием стерильного раствора Рингера для холоднокровных животных (103 мМ NaCl, 1.9 мМ KCl, 0.45 мМ CaCl2, 1.4 мМ MgSO4, рН 7.0). Затем 1 мл разведенного препарата высевали в 100 мл жидкой питательной среды (МПБ — мясо-пептонный бульон). При таком разведении активность гидролаз беспозвоночных сводилась к нулю. Культивирование проводили в колбах с пробоотборниками в термостате при температуре 28°С в течение 48 ч при регулярном перемешивании.
Для приготовления гомогенатов из тканей животных материал изначально разводили раствором Рингера в соотношении 1 : 9. Затем в зависимости от начальной активности гликозидаз гомо-генаты зоопланктона, бокоплавов и личинок хирономид дополнительно разводили в 5, олиго-хет — в 15, дрейссены — в 10 раз.
Общую амилолитическую активность (ОАА) (суммарную активность а-амилазы, КФ 3.2.1.1, у-амилазы, КФ 3.2.1.3 и ферментов группы маль-таз, КФ 3.2.1.20) определяли методом Нельсона в модификации А.М. Уголева и Н.Н. Иезуитовой [22]. В качестве субстрата использовали 1%-ный раствор растворимого крахмала, приготовленный
на растворе Рингера (рН 5.0—10.0). Гомогенаты и субстраты доводили до соответствующих значений рН с помощью рН-метра марки рХ-150 МИ. Ферментативно активные препараты и субстрат инкубировали при температуре 20°C в течение 30 мин. Интенсивность окраски оценивали на фотоколориметре КФК-2 (длина волны 670 нм). Активность ферментов в каждой точке определяли в пяти повторностях с учетом фона (изначальное количество гексоз в пробе). Результаты обработаны статистически с использованием стандартного пакета программ (Microsoft Office XP приложение Excel) и приведены в виде средней ± m. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента для малых выборок прир < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Общая амилолитическая активность в тканях всего организма беспозвоночных при значении рН 7.4, рассматриваемом в качестве стандартного для энтеральной среды, увеличивается в ряду: бокоплав — 1.7 ± 0.09, суммарный зоопланктон — 2.1 ± ± 0.10, личинки хирономид — 2.1 ± 0.10, дрейссена — 4.6 ± 0.09, олигохеты — 7.0 ± 0.17 мкмоль/(г • мин). Различия в уровне ОАА у всех видов, кроме суммарного зоопланктона и личинок хирономид, статистически достоверны (р < 0.05). Уровень ОАА микробиоты при том же значении рН не всегда совпадает с таковым беспозвоночных. В частности, ОАА у микробиоты представителей рачко-вого планктона и бокоплава (1.15 ± 0.09 и 1.41 ± ± 0.14 мкмоль/(г • мин) соответственно) ниже по сравнению с таковым у видов, входящих в состав бентофауны: личинки хирономид — 2.76 ± 0.11, дрейссена — 5.42 ± 0.13, олигохеты — 5.91 ± 0.11 мкмоль/(г • мин). Различия в уровне ОАА у видов, входящих в состав бентоса, статистически достоверны (р < 0.05).
Характер рН-зависимости ОАА у всех исследуемых видов беспозвоночных и их микробиоты достаточно близок (рис. 1 и 2). Максимальный уровень ОАА отмечен при рН 7.0, минимальный — при рН 10.0. В зоне низких значений рН (особенно при рН 5.0) наблюдаются видовые различия рН-зависимости ОАА как у беспозвоночных, так и у сопутствующей микробиоты. У бокоплава и олигохет, а также их микробиоты величины относительной ОАА (~20 и 40% максимальной активности) при рН 5.0 близки. При этом же значении рН у представителей рачкового зоопланктона и дрейссены относительная активность ферментов ниже, чем у сопутствующей микробиоты, у личинок хирономид, напротив, — выше. Особо следует отметить высокий уровень относительной активности гликозидаз у микробиоты рачкового зоопланктона — 75% максимальной активности.
Степень изменения ферментативной активности в зоне кислых и щелочных значений рН по
5 7 9 11 5 7 9 11
pH
Рис. 1. Влияние рН на общую амилолитическую активность бокоплава (а, б), суммарного зоопланктона (в, г) и сопутствующей микробиоты: а, в — активность гликозидаз, мкмоль/(г • мин), б, г — доля максимальной; 1 — беспозвоночные, 2 — микробиота.
сравнению с максимальной активностью у разных видов животных и их микробиоты различна. Так, при увеличении рН от 5.0 до оптимальных значений ферментативная активность у личинок хирономид увеличивается в 2.2, у олигохет — в 2.6, у представителей зоопланктона и дрейссены — в 3.9, у бокоплава — в 4.2 раза. Общая амилолитиче-ская активность микробиоты зоопланктона увеличивается в 1.3, дрейссены — в 1.7, олигохет — в 2.9, хирономид — в 4.9, бокоплава — в 5.6 раза. При увеличении рН от оптимальных значений до 10.0 степень изменения ОАА еще более значительна: у хирономид ферментативная активность уменьшается в 3.6, у дрейссены — в 6.4, у бокоплава — в 6.6, у олигохет — в 9.3, у зоопланктона — в 16.4 раза. Ферментативная активность микробиоты при этих же значениях рН уменьшается у
дрейссены в 3.1, у олигохет — в 4.7, у зоопланктона — в 8, у хирономид — в 10.8, у бокоплава — в 14.3 раза.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Уровень активности гликозидаз у рыб, относящихся по типу питания к группам планкто- и бентофагов, в значительной мере зависит от спектра питания и биохимического состава их объектов пи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.