ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 6, с. 610-615
УДК 547.995.12:577.152.32:579.852.11
ВЛИЯНИЕ ПОЛИКАТИОНОВ НА АНТИБАКТЕРИАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛИЗОСТАФИНА
© 2015 г. С. Н. Куликов*, **, ***, Р. З. Хайруллин*, ***, В. П. Варламов****
*Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора, Казань, 420015
e-mail: kuliks@yandex.ru **Казанский федеральный университет, Казань, 420008 ***Казанский национальный исследовательский технологический университет, Казань, 420015
e-mail: khairullinrz@gmail.com ****Центр "Биоинженерия"РАН, Москва, 117312 e-mail: varlamov@biengi.ac.ru Поступила в редакцию 14.05.2015 г.
Показан эффект синергизма лизостафина и поликатионов различной химической структуры при проявлении антибактериальной активности против Staphylococcus aureus. Поликатионы усиливали литическое действие лизостафина на пептидогликан стафилококков. Высказано предположение, что при этом уменьшалось связывание положительно заряженного лизостафина с тейхоевыми кислотами клеточных стенок S. aureus. Полученные данные открывают перспективы для поиска поликатионов, усиливающих эффект синергизма при действии лизостафина и других антибактериальных белков на стафилококки.
Ключевые слова: поликатион, хитозан, полиэтиленимин, полиаллиламин, лизостафин, Staphylococ-cus aureus, синергизм, антибактериальная активность.
DOI: 10.7868/S0555109915060082
Борьба с инфекционными заболеваниями, вызываемыми резистентными штаммами бактерий рода Staphylococcus, и, в частности, золотистым стафилококком (Staphylococcus aureus), является одной из наиболее актуальных проблем медицины на протяжении длительного времени. Поэтому поиск новых лекарственных средств, альтернативных антибиотикам, а также разработка новых подходов в лечении стафилококковых инфекций является важной задачей.
Одним из таких средств является лизостафин — фермент (КФ 3.4.24.75), впервые выделеный более полувека назад из культуральной жидкости S. simu-lans biovar staphylolyticus [1]. Благодаря своей способности расщеплять пентапептидные глициновые мостики в структуре муреина, характерные именно для S. aureus, лизостафин рассматривается как перспективный антистафилококковый агент. Была показана высокая эффективность этого белка против S. aureus как в опытах in vitro, так и в исследованиях на животных [2].
Однако, потенциальная иммуногенность лизостафина и сложность его очистки от сопутствующих примесей, содержащихся в культуральной жидкости S. simulans, затрудняли практическое применение этого белка. Одно из решений этой проблемы включает получение рекомбинантного белка, для
биосинтеза которого используется промышленный штамм Ьа^ососст \actis [3]. Второе — получение фермента, иммобилизованного в матрице по-лиэтиленгликоля, что позволяет предотвратить его взаимодействие с антителами сыворотки и сохранить высокую активность [4].
Известно, что при совместном использовании лизостафина с классическими антибиотиками [5—7], антимикробными пептидами [8] и белками [9] обнаруживается синергический эффект в проявлении антистафилококковой активности. Это дает возможность снизить количество используемого фермента при сохранении высокой антиста-филококовой активности. Антибактериальные белки могут иметь существенное преимущество перед классическими антибиотиками вследствие того, что они в гораздо меньшей степени вызывают формирование резистентности у штаммов стафилококка [10].
Многие антибактериальные пептиды обладают катионной природой [8, 11] и связываются с отрицательно заряженными компонентами клеточных стенок бактерий и мембранными структурами, что играет определяющую роль в проявлении антибактериальных свойств [12]. В связи с этим представляет интерес изучение возможности достижения синергизма в проявлении анти-
бактериальной активности лизостафина (как и антибактериальных пептидов) в присутствии поликатионов небелковой природы и, в первую очередь, хитозана, единственнного поликатиона естественного происхождения — продукта дезацетилирова-ния хитина, относящегося к антистафилококковым агентам [13]. Хитозан получают в больших количествах с высокой степенью химической чистоты и этот продукт обладает умеренной стоимостью [14]. Ранее было установлено, что хитозан способен усиливать лизис термически инактивирован-ных клеток S. aureus лизостафином [15]. В связи с этим представляется актуальным изучить действие лизостафина на живые клетки S. aureus в присутствии поликатиона хитозана, а также других синтетических поликатионов.
Цель работы — изучение лизиса клеток S. aureus лизостафином и изменения его антибактериальной активности в присутствии биогенных и синтетических поликатионов.
МЕТОДИКА
В работе использовали высокомолекулярный хитозан краба со средневязкостной молекулярной массой (Мщ) 600 кДа и степенью дезацетили-рования 85% (ЗАО "Биопрогресс", Россия). Для приготовления рабочего раствора хитозан растворяли в 1 М уксусной кислоте и осажадали 0.5 М гидроксидом натрия. Осадок отделяли центрифугированием при 2000 g, ресуспендировали в воде и растворяли, добавляя 0.1 М соляную кислоту. После полного растворения переосажденного хитозана рН раствора доводили до 6.4 0.5 М гидрок-сидом натрия и стерилизовали в автоклаве в течение 15 мин.
Использованы также синтетические положительно заряженные полимеры: полиэтеленимин (ПЭИ) с молекулярной массой 600 кДа и полиал-лиламин (ПАА) с молекулярной массой 70 кДа ("Sigma", США).
Штамм S. aureus ATCC 35591, использованный в работе, хранили в полужидком мясо-пептонном агаре (МПА) при 4°C. Для выращивания бактерий в колбу емкостью 100 мл, содержащую 20 мл мясо-пептонного бульона (МПБ), добавляли 5% суспензии бактериальной культуры и инкубировали на качалке при 150 об./мин в течение 18 ч при 37°С.
Использовали лизостафин из S. staphylolyticus ("Sigma", США), содержащий 60% белка со специфической активностью 500 Е/мг белка.
Оценку лизирующей активности лизостафина и влияние на этот процесс хитозана проводили в соответствии с модифицированным методом, описанным в работе [15]. Количество фермента было подобрано таким образом, чтобы в течение 30 мин оптическая плотность клеточной суспензии уменьшалась примерно на одну треть от исходного зна-
чения. В 96-луночном плоскодонном планшете готовили различные концентрации хитозана в 0.15 M MES-Na буфере, рН 6.4, методом двойных разведений и в каждую лунку добавляли в качестве субстрата суспензию живых клеток S. aureus, оптическая плотность которых при 620 нм была равна 0.300 (8 х 107 КОЕ/мл) и лизостафин до конечной концентрации 1 Е/мл. Полученную смесь инкубировали в термошейкере "Elmi" ST-3 (Латвия) при 350 об./мин и 37°С, измеряя оптическую плотность при 620 нм на планшетном фотометре "Эфос" 9305 (Россия).
Количество живых клеток S. aureus подсчитывали после посева суспензии на чашки Петри с МПА и инкубации в течение 24 ч при 37°С.
Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) поликатионов исследовали как описано в работе [11]. Для этого в 96-луночном плоскодонном планшете готовили разведения лизостафина и хитозана. К этим растворам добавляли суспензию бактерий в питательной среде с конечной концентрацией 2 х 105 КОЕ/мл. После инкубации в течение 24 ч при 37°С оценивали наличие или отсутствие роста культуры в лунках планшета.
Для расчета среднеквадратичного отклонения (а) экспериментальных данных использовали программу Microsoft Excel. Результаты считали достоверными при а < 10%. При расчете достоверности получаемых разностей использовали критерий Стьюдента, принимая P< 0.05 за достоверный уровень значимости.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Лизостафин — внеклеточная цинксодержащая глицил-глициновая эндопептидаза (фермент, расщепляющий пептидные связи глицин-глицин в белках), штаммом-продуцентом которой является S. simulans biovar staphylolyticus. Лизостафин разрушает клеточные стенки микроорганизмов рода Staphylococcus, гидролизуя полиглициновые межпептидные мостики в пептидогликане, встречающиеся только в клеточной стенке стафилококков [2]. Для определения ферментативной активности лизостафина используется стандартный метод оценки изменения оптической плотности суспензий живых или инактивированных клеток микроорганизмов или компонентов их клеточных стенок [11, 15—17]. В работе в качестве субстрата лизостафина использовались живые клетки S. aureus. На рис. 1 приведены результаты изучения влияния поликатионов на лизис клеток S. aureus лизостафином. Видно, что присутствие полимеров усиливало действие лизоста-фина, поскольку оптическая плотность бактериальной суспензии по сравнению с вариантом без добавления поликатионов была ниже. Величина снижения оптической плотности зависела от кон-
A620 0.32
0.30
0.28
0.26
0.24
0.22
0.20
0.18
0.16
0.14
0.12
(а)
A
il il:
0.19 0.39 0.78 1.5 3.1 6.2 12 25 50
мкг/мл
620
(б)
A620 0.32
0.30
0.28
0.26
0.24
0.22
0.20
0.18
0.16
0.14
0.12
0.19 0.39 0.78 1.5 3.1 6.2 12 25 50
мкг/мл
(в)
0.19 0.39 0.78 1.5 3.1 6.2 12 25 50
мкг/мл
Рис. 1. Влияние хитозана (а), ПЭИ (б) и ПАА (в) на лизис клеток S. aureus в отсутствии и присутствии лизостафина
а: 1 — хитозан, 2 — хитозан + лизостафин; б: 1 — ПЭИ, 2 — ПЭИ + лизостафин; в: 1 — ПАА, 2 — ПАА + лизо-стафин
Верхняя пунктирная линия — ОП бактериальной суспензии до добавления лизостафина, нижняя — после инкубации с лизостафином.
центрации полимера. В присутствии 0.39 мкг/мл хитозана лизис клеток усиливался, достигая маси-мума при его концентрации 3.1 мкг/мл. Дальнейшее увеличение концентрации хитозана не оказывало влияния на изменение оптической плотности суспензии клеток (рис. 1а). Аналогичные данные были получены при внесении в суспензии клеток синтетических поликатионов: ПЭИ и ПАА (рис. 1б, в). Так, ПАА снижал оптическую плотность бактериальной суспензии при концентрации 0.19 мкг/мл, достигая максимального эффекта при 1.5 мкг/мл (рис. 1в). В отсутствии фермента поликатионы практически не изменяли оптическую плотность клеточной суспензии (рис. 1).
На рис. 2 представлены результаты влияния различных концентраций хитозана на количество живых клеток бактерий. Было установлен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.