БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 2, с. 117-121
УДК 612.111:612.117
ВЛИЯНИЕ ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ
ЧЕЛОВЕКА НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ЛИПОПОЛИСАХАРИДОМ Escherichia coli 055:B5
© 2008 г. Д. С. Кабанов, Ä. Ю. Иванов*, М. Мелцер**, И. Р. Прохоренко
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290 Пущино Московской обл., ул. Институтская, 2; тел.: (4967)73-36-01; факс: (4967)33-05-32; электронная почта: kabanovd1@rambler.ru;
* Институт биофизики клетки РАН, 142290 Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3; тел.: (4967)73-93-88; факс: (4967)79-05-09; электронная почта: admin@ibfk.nifhi.ac.ru;
**Институт генетики культурных растений, D-06466 Гатерслебен, Германия, Корренштрассе, 3; тел.: +49 39482 5471; факс: +49 39482 5139; электронная почта: melzer@ipk-gatersleeben.de Поступила в редакцию 06.04.2007 г.
После доработки 08.11.2007 г.
Роль поверхностных белков и заряда мембраны эритроцитов человека во взаимодействии с липо-полисахаридом (ЛПС) из Escherichia coli 055:В5 (ЛПС£ coU) исследована двумя независимыми методами: проточной цитофлуориметрией и клеточным электрофорезом. Модификация стереохимических свойств поверхности клеток трипсином вызывала увеличение интенсивности флуоресценции эритроцитов после их инкубации с ЛПС£ coK, меченным флуорофором, на 16%, а также снижение относительных значений электрофоретической подвижности (ЭФП) клеток до 16%. Удаление сиаловых кислот с поверхности эритроцитов нейраминидазой не оказывало значительного влияния как на относительные значения ЭФП эритроцитов, так и на интенсивность флуоресценции после инкубации клеток с ЛПС. Таким образом, установлено, что определяющую роль при встраивании S-структуры ЛПС в мембраны эритроцитов человека играют стереохимические факторы, тогда как роль заряда поверхности клетки не столь значима.
Липополисахариды (ЛПС, эндотоксины) грам-отрицательных бактерий взаимодействуют со всеми типами клеток организма человека, включая эритроциты [1, 2]. Поступление эндотоксинов в кровоток происходит при делении бактерий и разрушении бактериальных клеток антибиотиками [3, 4]. В кровеносном русле эритроциты с встроенными в мембрану молекулами ЛПС способны взаимодействовать с нейтрофилами и активировать их [5], таким образом, участвуя в развитии синдромов сепсиса. Вовлечение эритроцитов в процессы, связанные с патологией кровеносной системы, обусловлено влиянием эндотоксинов на морфологию [6] и эластичность мембраны [7], а также на заряд поверхности эритроцитов [2]. Методом клеточного электрофореза показано, что достоверное изменение электроповерхностных характеристик эритроцитов при взаимодействии с эндотоксинами вызывают только ЛПС Б-структуры [8].
Взаимодействие между ЛПС и эритроцитами зависит не только от свойств молекул ЛПС, но и от физико-химических характеристик поверхности клетки. Поверхность эритроцитов человека содержит большое количество гликопротеинов и ган-глиозидов, а также имеет отрицательный заряд,
обусловленный К-ацетилнейраминовой кислотой (№иАс), в основном входящей в состав гликофо-ринов мембраны клетки [9]. В настоящее время известно, что при различных патологических процессах в организме изменяются физико-химические свойства мембраны эритроцитов [10, 11]. В частности, клетки бактерий, а также некоторые вирусы при прикреплении к эритроцитам секрети-руют протеазы и гликозидазы (сиалидазы) [12-14], которые модифицируют поверхностные структуры эритроцитов. Протеазы, гидролизующие поверхностные белки, вызывают не только снижение заряда поверхности мембраны, но также изменяют ее стереохимические свойства. Подобные изменения свойств мембраны эритроцитов происходят и при старении клетки [15]. Изменение стереохимических характеристик и поверхностного заряда мембраны может оказывать влияние на взаимодействие эритроцитов с эндотоксинами, их последующее встраивание в мембрану клетки, и, следовательно, иметь большое значение в развитии синдромов шока, вызванного грамотрицатель-ными бактериями.
В связи с этим мы исследовали роль заряда и белков поверхности мембраны эритроцитов чело-
Таблица 1. ЭФП эритроцитов человека, обработанных нейраминидазой и трипсином
Эритроциты ЭФП, мкм с-1 В-1 см Относительное изменение ЭФП, %
Нативные -1.26 ± 0.007 -
Обработанные -0.779 ± 0.008
нейраминидазой Р < 0.001 38
Обработанные -0.858 ± 0.010
трипсином Р < 0.001 32
Примечание. В таблице представлены данные трех независимых экспериментов.
века во взаимодействии с ЛПС из Escherichia coli 055:В5 двумя независимыми методами: клеточным электрофорезом и проточной цитофлуори-метрией.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы. В работе использовали коммерческие препараты: ЛПС из E. coli O55:B5 ("Sigma", Германия); ЛПС из E. coli O55:B5, меченный флуоресцентной меткой "Alexa" с максимумом возбуждения при 494 нм и максимумом флуоресценции при 519 нм ("Molecular Probes," Германия). Ферменты: трипсин из поджелудочной железы быка (40 ед/мг, "Serva," Германия); нейраминидаза (сиалидаза) из Clostridium perfringens (4.7 ед/мг, "Sigma," Германия).
Эритроциты. Забор крови осуществляли по стандартной методике [16] без антикоагулянтов (1 мл крови к 9 мл раствора 0.9% NaCl). Эритроциты трижды отмывали 0.9% раствором NaCl для удаления белков плазмы, которые способны частично нейтрализовать и экранировать поверхностный заряд клеток. Количество клеток определяли в камере Горяева. Исходное количество эритроцитов до-
водили до 5 х 106 клеток/мл разведением в забуфе-ренном физиологическом растворе (ЗФР: 0.137 М NaCl, 1.5 мМ KH2PO4, 8.0 мМ Na2HPO4, 3.0 мМ KCl; удельная электропроводность 5.6 х 10-2 См/м, рН 7.4).
Обработка клеток ферментами. Обработку эритроцитов ферментами проводили согласно [17]. Клетки инкубировали в буфере для трипсино-лиза (0.2 М Na2HPO4, 0.2 М NaH2PO4; рН 8.5) с концентрацией трипсина в растворе 1 мг/мл в течение 1 ч при 37°С. Для гидролиза олигосахаридов глико-протеинов на поверхности эритроцитов, приводящего к высвобождению сиаловых кислот, клетки инкубировали с нейраминидазой (3.5 мкг/мл) в ЗФР в течение 15 мин при 37°С. Затем клетки промывали 5 раз ЗФР для удаления продуктов гидролиза. В качестве контроля использовали интакт-ные эритроциты, не подвергнутые обработке ферментами.
Встраивание эндотоксинов в мембраны на-тивных и обработанным ферментами эритроцитов. Эритроциты (5 х 106клеток/мл) инкубировали с ЛПС в концентрации, близкой к порогу насыщения мембраны (70 мкг/мл) в ЗФР в течение 1 ч при 37°С [2]. После инкубации клетки дважды промывали ЗФР и ресуспендировали в 1 мл этого раствора.
Оценка уровня флуоресценции эритроцитов.
Влияние внешних белков эритроцитов и заряда поверхности мембраны на взаимодействие и встраивание ЛПС в фосфолипидный бислой клетки оценивали, сравнивая уровень флуоресценции натив-ных и обработанных ферментами эритроцитов, определенный с помощью проточного цитофлуо-риметра BDFACS Aria и конфокального микроскопа CLSM 510 META фирмы "Carl Zeiss" (Германия).
Определение электрофоретической подвижности клеток. Суспензии контрольных эритроци-
Таблица 2. ЭФП нативных эритроцитов человека и обработанных ферментами эритроцитов до и после инкубации с ЛПС£. coU
Эритроциты ЭФП, мкм с-1 В-1 см Относительное изменение ЭФП, %
Перед инкубацией С ЛПС£. coli После инкубации с ЛПС£. coli
Нативные клетки -1.26 ± 0.007 -1.17 ± 0.011 7
Р < 0.001
Обработанные нейраминидазой -0.779 ± 0.008 -0.744 ± 0.008 5
Р < 0.001 Р < 0.024
Обработанные трипсином -0.858 ± 0.010 -0.717 ± 0.009 16
Р < 0.001 Р < 0.001
Примечание. В таблице представлены данные трех независимых экспериментов.
тов и эритроцитов, обработанных ферментами, в концентрации 3 х 105-5 х 105 клеток/мл в ЗФР готовили непосредственно перед измерением после взаимодействия с ЛПС. ЭФП эритроцитов определяли по скорости перемещения клеток в электрическом поле [18] с помощью микроскопа Parmo-quant-2 фирмы "Carl Zeiss" (Германия) в ручном режиме. В каждой пробе измеряли перемещение 20 клеток при 20°С; затем вычисляли среднее значение ЭФП, величины стандартных отклонений и среднеарифметических ошибок для каждой пробы. Достоверность результатов определяли по критерию Стьюдента-Фишера. Каждый эксперимент проводили в день забора крови.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Липополисахариды являются амфифильными молекулами, несущими отрицательный заряд [19]. Взаимодействие и последующее встраивание ЛПС в мембраны определяются как зарядом и гидро-фобностью собственно молекул эндотоксинов, так и физико-химическими свойствами поверхности клетки-мишени.
Для исследования влияния стереохимиче-ских факторов и заряда поверхности клетки на взаимодействие ЛПС с мембраной эритроцитов мы использовали обработку клеток ферментами (нейраминидазой или трипсином). Нейрами-нидаза из C. perfringens специфически гидроли-зует а-(2—-3)-, а-(2—»6)-, а-(2—-8)-гликозид-ные связи между NeuAc и галактозой гликопротеинов и ганглиозидов мембраны эритроцитов человека, что приводит к значительному снижению ЭФП клеток [20]. Необходимо отметить, что а-(2—«-3)-связь быстрее гидролизуется нейраминидазой, чем а-(2—>-6)- или а-(2—«^-связи [21]. Это имеет принципиальное значение, поскольку в ганглиозидах [22, 23] и гликофоринах мембраны [24] эритроцитов человека превалирует а-(2—«-3)-связь. В отличие от нейраминидазы, действие трипсина направлено на пептидную связь белковых молекул поверхности клеток. Известно, что большинство белков поверхности мембраны эритроцитов человека гидролизуется трипсином [25-30]. Гидролиз гликопротеинов, в состав которых входит NeuAc, сопровождается как снижением отрицательного заряда, так и изменением сте-реохимических свойств поверхности мембраны. Вклад каждого из этих факторов во взаимодействие с ЛПС£ coli исследовали с помощью клеточного электрофореза, конфокальной лазерной микроскопии и проточной цитофлуориметрии.
Сравнительный анализ влияния ферментов на ЭФП эритроцитов показал более выраженный эффект нейраминидазы в сравнении с трипсином (табл. 1). Взаимодействие модифицированных эритроцитов с ЛПС£ coli вызывало дальнейшее уменьшение ЭФП клеток (табл. 2). Снижение
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.