БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 3, с. 218-225
УДК 618.14-006-092.9
ВЛИЯНИЕ ПОВЫШЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГЕНА/БЕЛКА ОПУХОЛЕВОГО СУПРЕССОРА PTEN НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ МАЛИГНИЗИРОВАННЫХ КЛЕТОК К ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ
ПРЕПАРАТАМ
© 2007 г. Е. Ä. Щербакова*, Т. П. Стромская, Е. Ю. Рыбалкина, Ä. Ä. Ставровская
НИИ канцерогенеза, ГУ Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН, 115478 Москва, Каширское ш. 24; электронная почта: scherbakova_katya@yahoo.com
Поступила в редакцию 26.10.2006 г.
Исследовали влияние антионкогена PTEN на чувствительность опухолевых клеток к цитостатикам. В результате стабильной трансфекции фибробластов крысы, содержащих активированный онкоген ras (N-rasAsp12), генетической конструкцией, несущей полноразмерный ген PTEN, получен клон клеток, в которых повышена экспрессия гена PTEN. Показано, что экспрессия экзогенного гена PTEN сообщает клеткам ряд признаков нормализации. Изучено влияние транзиторной трансфекции клеток геном PTEN на их чувствительность к двум цитостатикам (колхицину и адриабластину) c разными внутриклеточными мишенями и различным механизмом действия. Использовали линии опухолевых клеток разного гистогенеза и видовой принадлежности, различающиеся по чувствительности к противоопухолевым препаратам (родительские и полученные из них устойчивые за счет гиперэкспрессии Р-гликопротеина варианты). Введение гена PTEN замедляло размножение клеток всех линий, что свидетельствует в пользу активности трансгена, не влияло на чувствительность родительских линий клеток к лекарственным средствам, но изменяло чувствительность некоторых лекарственно-устойчивых сублиний. Обнаружено, что чувствительность этих клеток к цитостатикам может как повышаться, так и понижаться. Влияние гиперэкспрессии гена PTEN на чувствительность клеток к цитостатикам зависит как от механизма действия этих веществ, так и от клеток, в которые введен трансген. Наши данные позволяют полагать, что в исследованных нами устойчивых клетках активируются молекулярные механизмы, в которые вовлечен PTEN.
Канцерогенез - многоступенчатый процесс накопления мутаций и других генетических изменений, приводящих к нарушению регуляции пролиферации и дифференцировки клеток. Только совокупность таких изменений может обеспечить развитие злокачественного новообразования. Открытие онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста стало переломным этапом в понимании механизмов возникновения рака. Показано, что превращению нормальной клетки в опухолевую способствует активация онкогенов и инактивация генов-супрессоров. Геном человека содержит по меньшей мере несколько десятков опухолевых су-прессоров. Дисфункция кодируемых ими белков приводит к нарушению регуляции сигнальных путей, контролирующих клеточный цикл, апоптоз и дифференцировку [1]. Мутации в гене-супрессоре РТЕЫ встречаются в спорадических новообразованиях различного типа. Например, мутации в гене РТЕЫ выявлены в 36-60% образцов рака эндометрия [2, 3]. В 30-40% глиобластом и примерно в 30% случаев рака молочной железы [4] этот ген инак-тивирован. Наследственные мутации в гене РТЕЫ приводят к развитию синдрома Каудена (Cowden
* Адресат для корреспонденции.
syndrome), который характеризуется множественными гамартомами (опухолевыми новообразованиями, возникающими при нарушении формирования эмбриональных тканевых комплексов) и повышенным риском возникновения рака молочной, щитовидной и предстательной железы [5]. Участие белка PTEN прослеживается во многих сигнальных путях. Исследования последних лет показали, что PTEN участвует в индукции апоптоза, остановке клеточного цикла в фазе G1 и в других важных клеточных процессах. Эти функции связаны с ингибированием важнейшего клеточного регулятора - фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), и тем самым характеризуют PTEN как опухолевый ген-супрессор [6].
В последнее время не исключают участия гена PTEN в контроле апоптоза и во влиянии на чувствительность опухолевых клеток к целому ряду химиотерапевтических препаратов. Становится понятным, что существуют различные механизмы лекарственной устойчивости опухолей, которые в значительной степени зависят от совокупности особенностей протекающих в клетке процессов, обусловленных видовой и тканевой принадлежностью клеток, а также теми генетическими изменениями, которые происходят в клетке при малигни-
зации и прогрессии новообразования. В настоящее время на первый план выходит изучение генов и белков, контролирующих апоптоз и выживаемость клеток (PTEN, p53, Bcl-2 и др.), а также участвующих в основных защитных механизмах (P-гликопротеин, MRP, LRP и др.). Важно понимать, что в одной и той же клетке могут одновременно "работать" сразу несколько механизмов клеточной защиты, и они могут быть взаимосвязаны. Взаимосвязь различных механизмов лекарственной устойчивости изучена недостаточно.
Целью данной работы было изучить влияние повышения активности гена/белка PTEN на изменение лекарственной устойчивости клеток.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Культивирование клеток. В работе использовали культивируемые in vitro клетки млекопитающих: Rat-1 - иммортализованные фибробласты крысы и полученная из них линия Rat/ras с активи-рованым онкогеном N-rasAsp12 [7]; КВ 3-1 - клетки карциномы полости рта человека; MCF-7 - клетки аденокарциномы молочной железы человека; HET-SR-2SC-LNM-RSV(2SC) - трансформированные фибробласты сирийского хомяка [8], а также соответствующие им устойчивые к цитостатикам варианты - КВ 8-5 [9], MCF-7/Adr (к адриабласти-ну [10]), 2SC/20-2 (к колхицину [11]). Устойчивые варианты получены в результате отбора клеток на колхицине (линия 2SC/20-2) и на адриабластине (линия MCF-7/Adr) или после обработки мутагеном и отбора на колхицине (линия КВ 8-5). Клетки культивировали в среде DMEM c добавлением 10% эмбриональной сыворотки ("GIBCO", Англия) и гентамицина (50 мкг/мл) при температуре 37°С в атмосфере 5% СО2.
Трансфекция клеток кальций-фосфатным методом. Стабильная трансфекция. За день до трансфекции клетки Rat/ras рассевали из расчета 30 x 104 клеток на чашку Петри диаметром 60 мм ("Corning", США). За 3 ч до трансфекции меняли среду на новую. Плазмида, содержащая ген PTEN, и контрольная плазмида PC ("пустая") любезно предоставлены Э. Ченом (Andrew Chan, США). Поскольку клетки Rat/ras не содержат селективного маркера, мы котрансфицировали их плазмидой, содержащей ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) и ген neo, определяющий устойчивость к неомицину (G418). Раствор ДНК (6-12 мкг PTEN или PC и в 10 раз меньше GFP/neo), CaCl2 (250 мМ) в трис-EDTA pH 7.9 по каплям добавляли в раствор 2 x HBS pH 7.1. Смесь оставляли на 30 мин при комнатной температуре для созревания преципитата. После этого по каплям добавляли смесь в чашки (0.4 мл смеси на 3.6 мл среды). На следующий день среду заменяли свежей. На другой день в среду добавляли селективный антибиотик G418 в концентрации 400 мкг/мл. Таким образом клетки культивировали 10-14 дней.
Транзиторная трансфекция. За день до трансфекции клетки рассевали из расчета 3 х 104 клеток на лунку 24-луночной планшеты ("Costar", США). За 3 ч до трансфекции среду заменяли свежей (по 0.5 мл на лунку). За 1 ч до трансфекции готовили раствор ДНК и раствор 2 х HBS в тех же соотношениях, что и в опытах со стабильной трансфекци-ей. После этого по каплям в лунки добавляли по 50 мкл смеси. На следующий день среду заменяли свежей (1 мл).
Вестерн-блотинг. Клетки (2 млн.) суспендировали в 50 мкл лизирующего буфера, приготовленного из пятикратного (1 M трис-HCl pH 6.8, 10% SDS, 50% глицерин, 10% ß-меркаптоэтанол, бром-феноловый синий). Белки разделяли в 10% полиа-криламидном геле, переносили на нитроцеллюлоз-ную мембрану ("Amersham", Англия). Далее следовали методике, описанной ранее [12]. Использовали следущие поликлональные антитела: мышиные антитела против PTEN ("Santa Cruz", США), разведение 1 : 1000; кроличьи антитела против фосфо-AkÜ (Ser473) ("Chemicon", США), 1 : 500; мышиные антитела против актина ("Chemicon"), 1 : 1000; кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши и козы, конъюгированные с пероксидазой хрена (1 : 4000). Проявление осуществляли с помощью реагента ECL ("Amersham").
Оценка скорости пролиферации. Клетки рассевали на 24-луночные планшеты ("Costar") по (2-4) х 104 клеток на лунку в 1 мл культуральной среды. Число живых клеток подсчитывали в камере Горяева на 2, 4, 6 и 8-й день после посева. Опыт повторяли дважды.
Оценка чувствительности клеток к колхицину и адриабластину. Клетки рассевали на 24-лу-ночные планшеты ("Costar") по (2-4) х 104 клеток на лунку в 1 мл культуральной среды. На следующий день проводили трансфекцию. Еще через день меняли среду на новую с добавлением колхицина или адриабластина в различных концентрациях. Через 4 сут инкубации при 37°С в 5% СО2 клетки снимали раствором Версена с трипсином и подсчитывали в камере Горяева под микроскопом. Контролем служили результаты, полученные на клетках, не подвергнутых воздействию цитостатиков.
Определение эффективности образования колоний клеток в присутствии селективного агента. Транзиторно трансфицированные клетки рассевали в чашки Петри диаметром 60 мм ("Corning") по 5 х 102 клеток на чашку в 4 мл среды роста с ци-тостатиками и инкубировали в течение 10 дней при 37°С в 5% СО2. Выросшие колонии окрашивали азур-эозином по Романовскому. Колонии, состоящие более чем из 50 клеток, подсчитывали под лупой (увеличение х10). Для каждой культуры ставили по два опыта по три чашки на каждую точку.
Окраска клеток на актинродамином-фалло-идином. Клетки рассевали на сколы покровных
Rat/ras
ЩЕРБАКОВА и др. Rat/ras-PTEN cl. 1-4
PTEN
pAkt
Актин
Рис. 1. Вестерн-блот-анализ экспрессии белка PTEN в клетках Rat/ras и в полученном из них клоне Rat/ras-PTEN cl.1-4. (Актин - контроль.)
Число клеток х 10 000 160 140 120 100 80 60 40 20 0
4 6
Дни культивирования
Рис. 2. Пролиферация клеток Rat/ras (1) и Rat/ras-PTEN cl.1-4 (2). Результаты двух опытов.
Rat-1
Rat/ras
Rat/ras-PTEN cl. 1-4
Рис. 3. Актиновый цитоскелет в клетках Rat/ras и Rat/ras-PTEN cl. 1-4. Иммуноцитохимическое окрашивание родамин-фа
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.