БИОФИЗИКА, 2009, том 54, вып.6, с. 1081-1087
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
УДК 577.3
ВЛИЯНИЕ П РЕПАРАТА ДИНИТР ОЗИЛЬНОГО КОМПЛЕКСА ЖЕЛЕЗА С ГЛУТАТИОНОМ И ЕГО КОМПОНЕНТОВ НА ИШЕМИЗИРОВАННОЕ СЕРДЦЕ КРЫСЫ ПРИ РЕПЕРФУЗИИ
© 2009 г. О.И. Писаренко, В.С. Шульженко, И.М. Студнева, Ю.А. Пелогейкина,
А. А. Тимошин, А.Ф. Ванин*
ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий»,
121552, Москва, 3-я Черепковская ул., 15а;
*Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, 119991, Москва, ул. Косыгина, 4
Поступила в р едакцию 01.12.08 г.
Изучено влияние препарата динитрозильного комплекса железа с глутатионом, лиофилизи-рованного на декстране, компонентов этого препарата - глутатиона, нитрозоглутатиона и декстрана, а также выделяющегося из динитрозильного комплекса железа оксида азота на энер гетический обмен и функцию изолир ованного пер фузируемого сердца крысы, подвергнутого глобальной ишемии и реперфузии. Показано, что введение 100 нМ динитрозильного комплекса железа с глутатионом после ишемии улучшало восстановление коронарного потока, сокр атительной и насосной функции пр и реперфузии, способствовало лучшему со хранению макроэргических фосфатов в реперфузированном миокарде и уменьшало повреждения клеточных мембр ан. Методом электр онного парамагнитного резонанса показано, что эти эффекты сопровождаются переносом Ре+^0+)2-групп с динитрозильного комплекса железа с глутатионом на тиолсодержащие белки кардиомиоцитов и клеток сосудов. Совместная инфузия 100 нМ динитрозильного комплекса железа с глутатионом и 25 мкМ перехватчика оксида азота - 2-фенил-4,4,5,5-тетраметил-имидазолин-1-оксил-3-оксида - после ишемии существенно снижала функциональное и метаболическое восстановление сердец. При введении 100 нМ аликвоты гидр олизата пр епарата динитр озильного комплекса железа с глутатионом (р аспав-шегося комплекса) восстановление большинства показателей функции сердца и коронарных сосудов, а также метаболическое состояние миокарда и повреждения мембран кардиомиоцитов достоверно не отличались от значений в контроле или были ниже их. Показано, что включение Ре+^0+)2-групп в ткань миокарда и спонтанное выделение оксида азота инициируют запуск механизмов кардиопротекторного действия динитрозильного комплекса железа с глутатионом на ишемизированное сердце.
Ключевые слова: динитрозильный комплекс железа с глутатионом, ишемизированное сердце крысы, энергетический обмен, функция сердца.
Способность оксида азота (N0) блокировать агрегацию тромбоцитов, инактивировать супероксидные радикалы и его вазодилататор-ные свойства обусловили интерес к изучению возможности снижения ишемических и репер-фузионных повреждений сердца с помощью экзогенных доноров N0 [1,2]. Динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) с низкомолекулярными тиолсодержащими лигандами (общая фор мула |(И8-)2Ре+^0+)2}+,где - Ь-цисте-
Сокращения: N0 - оксид азота, ДНКЖ - динитрозильные комплексы железа, ИМ - инфаркт миокарда, ОБИ -глутатион, АФК - активные формы кислорода, ДНКЖ-Глт - ДНКЖ с глутатионом, GSHN0 - Б-нитрозоглута-тион, РТЮ - 2-фенил-4,4,5,5-тетраметил-имидазолин-1-ок-сил-3-оксид, ЛДГ - лактатдегидроиназа, Кр - креатин, ФКр - фосфокреатин, ИСФ - интенсивность сократительной функции.
ин или восстановленный глутатион) способны обеспечить депонирование NO в организме и его транспорт к клеткам-мишеням [3]. В последние годы на различных экспериментальных объектах in vitro и in vivo, нар яду с гипотензивными эффектами, были пр одемонстр ир ова-ны пр отивоишемические свойства ДНКЖ с этими лигандами [4,5]. В этих работах было показано, что улучшение восстановления функции сердца и ограничение размеров инфар кта мио-кар да после тотальной или региональной ишемии под действием ДНКЖ сопровождаются лучшим сохранением энергетического обмена и меньшим повреждением мембран постишеми-ческих кардиомиоцитов. Обнаруженные кар-диозащитные эффекты могли быть обусловлены не только действием самого комплекса или выделяющегося из него NO, но также входящих
в состав препарата ДНКЖ декстрана, глута-тиона и нитрозоглутатиона, являющихся биологически активными соединениями.
Так, декстран при реперфузии поддерживает осмотическое давление в интерстиции и, тем самым, предохраняет сарколемму ишемизиро-ванных кардиомиоцитов от разрывов [6]. Три-пептид глутатион (ОБИ), благодаря наличию сульфгидрильной (-БИ) группы в остатке цис-теина, обладает антиоксидантным действием и уменьшает ишемическое и реперфузионное повреждение сердца [7,8]. Его потенциальное значение как протектора возрастает при ишемии миокарда, вызывающей снижение содержания эндогенного ОБИ [9], и особенно в условиях генерации активных форм кислорода (АФК), блокирующих активность эндотелиальной N0-синтазы и глутатионпероксидазы [10]. Образующийся в результате спонтанного или ферментативного распада динитрозильного комплекса железа с глутатионом (ДНКЖ-Глт) Б-нитрозо-глутатион (GSN0) также способен оказывать влияние на метаболизм миокарда. Оно связано с нитрозилированием белков, участвующих в регуляции энергетического обмена и тр анспор-та Са2+-митохондриальной Р1-АТФазы, а-ке-тоглутар атдегидрогеназы, Са2+-АТФазы сарко-плазматического ретикулума и а1-субъединицы Са2+-канала Ь-типа [11]. Снижение активности этих белков под действием GSN0 является защитным механизмом, обеспечивающим со хр а-нение энергии и снижение перегрузки ишеми-зир ованных кар диомиоцитов ионами Са2+ [12].
В связи с этим цель настоящей работы состояла в оценке действия ДНКЖ с глута-тионом в отсутствие и в присутствии перехватчика N0 - 2-фенил-4,4,5,5-тетраметил-ими-дазолин-1-оксил-3-оксида (РТ10), а также продуктов гидролитического распада препарата ДНКЖ на сердце, подвергнутое тотальной ишемии и реперфузии. К ритериями защиты/повреждения сердца служили: показатели сократительной и насосной функции сердца; метаболическое состояние миокарда и степень повреждения мембр ан кардиомиоцитов. Для исключения эффектов N0, обусловленных форменными элементами крови и нейрогуморальным влиянием, использована модель изолированного сердца крысы, перфузируемого буфером К ребса-Х ензелейта.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Приготовление препарата ДНКЖ. ДНКЖ с восстановленным глутатионом получали смешиванием растворов Б-нитр озоглутатиона в дистиллированной воде, комплекса двухвалент-
ного железа c цитратом (при соотношении железа и цитрата 1:5) и глутатиона в 15 мМ НEPES буфере (рН 7,4), в конечной концентр ации соответственно 15, 5 и 10 мМ. В HEPES буфер предварительно вводили декстран (5%) и NaCl (0,9%). S-нитрозоглутатион получали смешиванием растворов нитрита натрия (15 мМ) и глутатиона (15 мМ) в дистиллированной воде при рН 3. Полученный раствор ДНКЖ-Глт подвергали лиофильному высушиванию при -45°С. Полученный порошкообразный препарат ДНКЖ-Глт сохранял свои физико-химические свойства в течение года [13].
Получение гидролизованного ДНКЖ-Глт.
Препарат ДНКЖ-Глт растворяли в воде до концетрации 2,5 мМ. Часть маточного раствора использовали для инфузии в сердце во время реперфузии; концентрация ДНКЖ-Глт в раствор е К ребса составляла 100 нМ. О ставшуюся часть 2,5 мМ раствор а ДНКЖ-Глт подвер гали гидролизу при комнатной температуре в течение 72 ч. Об изменении содержания ДНКЖ-Глт во время гидролиза следили с помощью метода ЭП Р. Аликвоту раствора, содержащего компоненты ДНКЖ-Глт после гидролиза, использовали для инфузии в сердце пр и реперфузии.
Перфузия сердец. Опыты выполнены на изолированных сердцах кр ыс Wistar (масса тела и сердца 350 и 1,5 г соответственно). У наркотизированных уретаном животных (1,25 мг/г массы тела в/б) извлекали сердца и рет рогр адно пер фузировали в течение 10-15 мин раствором К ребса, насыщенным карбогеном (95% О2 + 5% СО2) при 37°С и постоянном перфузионном давлении 60 мм рт.ст. После этого осуществляли антеградную перфузию по Neely при постоянном давлении наполнения левого предсердия 15 мм рт.ст. и ср еднем перфузионном давлении в аорте 60 мм рт.ст. Состав раствора Кребса был следующим (в мМ): NaCl - 118,0; KCl -4,7; CaCl2 - 3,0; MgSO4 - 1,2; KH2PO4 - 1,2; Na2EDTA - 0,5; NaHCO3 - 25,0; глюкоза -11,0; рН 7,4 ± 0,1 при 37°C [14]. Давление в аорте и левом желудочке регистрировали при помощи тензометрических датчиков Р 50, монитора SP 1405 и регистр атор а SP 2010 (Gould Statham) [14].
После перфузии сердца по Neely в течение 15-20 мин регистр ир овали показатели функции сердца и коронарных сосудов (исходное состояние). Затем сердца подвергали глобальной нор-мотермической (37°C) ишемии в течение 35 мин. За ишемией следовала 5-минутная ретроградная инфузия раствора Кребса со скоростью 4 мл/мин и реперфузия по Neely в течение 25 мин. Выполнено четыр е серии опытов с инфу-зией в течение 5-мин после глобальной ишемии:
раствора Кребса без добавок (контроль); 100 нМ ДНКЖ-Глт (ДНКЖ-Глт); 100 нМ ДНКЖ-Глт гид-ролизованного (ДНКЖ-Глт л); 100 нМ ДНКЖ-Глт и 25 мкМ перехватчика N0 2-фенил-4,4,5,5-тетраметил-имидазолин-1-оксил-3-оксида (РТ10).
Повреждение клеточных мембран. В работе использовали два маркера - выход лактатде-гидрогеназы (ЛДГ) в перфузат на стадии ранней реперфузии и изменение содержания общего креатина (ХКр = фосфокреатин + креатин) в сердце к концу реперфузии. Оттекающий от сердца пер фузат собирали в охлажденные льдом пр обирки в течение 5 мин перед ишемией (исходное состояние) и в течение первых 5 мин реперфузии. Активность ЛДГ определяли немедленно после получения перфузатов на спектр офотометре Уапако И0-2000 при X = 340 нм, используя в качестве субстрата пируват. Содержание ХК р в безбелковых экстр актах ткани сер дца опр еделяли ферментативными методами.
Определение метаболитов в ткани сердца.
По окончании исходного состояния или реперфузии сердца замораживали щипцами Воллен-бергер а, охлажденными в жидком азоте. Замороженную ткань гомогенизир овали в холодной 6% НСЮ4 (10 мл/г ткани) с помощью гомогенизатора икга-Тиггах Т-25 (1КА-ЬаЪог1есЬшк, Германия). Белки о саждали центрифугированием при 3000 g и 4°С в течение 10 мин. Супер-натанты нейтрализовали 5 М К 2СО3 до рН 7,4. Осадок КСЮ4 отделяли центр ифугирова
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.