НЕЙРОХИМИЯ, 2011, том 28, № 3, с. 226-231
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ РАБОТЫ
УДК 612.821
ВЛИЯНИЕ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ГИПОКСИИ НА ЭКСПРЕССИЮ ТИОРЕДОКСИНА-1 В ГИППОКАМПЕ КРЫС НА РАЗНЫХ СРОКАХ
ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА
© 2011 г. С. А. Строев1,2, Е. И. Тюлькова2, *, Л. А. Ватаева3, М. О. Самойлов2, М. Т. Пельто-Хуикко1
1Отдел биологии развития, Медицинская школа Университета г. Тампере, Финляндия 2Лаборатория регуляции функций нейронов мозга, УРАН Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН,
Санкт-Петербург, Россия 3Лаборатория онтогенеза нервной системы, УРАН Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН,
Санкт-Петербург, Россия
В настоящей работе исследовали уровень экспрессии антиоксидантного белка тиоредоксина-1 в гиппокампе крысят, перенесших гипоксию в пренатальном периоде (14-16-е сут), на 3-и и 14-е сут после рождения, а также по достижению ими взрослого возраста (80-90-е сут после рождения). В целом при всех индивидуальных особенностях конкретных гиппокампальных областей и наличии связанных с этими особенностями исключений можно отметить общую тенденцию снижения у перенесших пренатальную гипоксию крыс (по сравнению с контрольными животными того же возраста) экспрессии тиоредоксина-1 на 3-и сут жизни, затем ее заметного повышения к 14-м сут после рождения. Во взрослом состоянии вновь наблюдается снижение экспрессии. Причем эти изменения наиболее выражены в области СА1 гиппокампа. Снижение активности физиологической антиоксидантной системы является важным показателем, характеризующим клеточно-мембран-ный гомеостаз, нарушение которого при гипоксии может приводить к развитию нейродегенератив-ных заболеваний.
Ключевые слова: пренатальная гипоксия, гиппокамп, тиоредоксин-1.
ВВЕДЕНИЕ
Гипоксия, перенесенная в пренатальном периоде, может оказывать неблагоприятное воздействие на последующее развитие мозга [1—3] и быть причиной возникновения различных патологий, таких, например, как шизофрения и болезнь Альцгеймера [4, 5]. В формировании пороков развития большое значение имеют сроки пренатального онтогенеза, на которые приходится повреждающее воздействие гипоксии [6—8]. В ряде ранее опубликованных работ нами было показано, что гипоксия, перенесенная на 14-16-е сут пренатального развития, оказывает существенное влияние на ряд поведенческих характеристик, таких как поведение в "открытом поле" [6], в приподнятом крестообразном лабиринте (неопубликованные данные), при выработке и воспроизведении условно-рефлекторной реакции пассивного избегания (УРПИ) [7] и при обучении в водном лабиринте Морриса [9]. Воздействие в более ранние (11—13-е сут) и более поздние (18-20-е сут) сроки оказывает менее заметное влияние на эти показатели либо не оказывает его вовсе. Эти данные
*Адресат для корреспонденции: 199034 Санкт-Петербург, наб. Макарова, д. 6; тел. (812)976-30-36 (доб. 331); e-mail: anoxia@pavlov. infran.ru.
свидетельствуют о том, что 14-16-е сут пренаталь-ного развития являются критическими для формирования определенных форм поведения и способности к обучению в более поздние сроки онтогенеза, что может найти отражение на молекулярно-кле-точном уровне. Именно этот срок пренатального развития был выбран для исследования в настоящей работе. Хотя механизмы, контролирующие обучение в лабиринте Морриса и УРПИ, различны, однако обе эти формы обучения осуществляются при непосредственном участии гиппокампа [8]. Имеющиеся в настоящее время данные позволяют предполагать, что в основе механизма формирования когнитивных и поведенческих нарушений, обусловленных действием гипоксии на 14-16-е сут пренатального развития, лежат функциональные изменения в нейронах гиппокампа.
Установлено также, что гипоксия, перенесенная самками крыс на 14-16-е сут беременности, существенно влияет на функциональное состояние внутриклеточных сигнальных систем у их потомков в период новорожденности и в зрелом возрасте. В частности, нами было показано влияние прена-тальной гипоксии на характер изменений уровня связанного внутриклеточного Са2+ в ответ на парную аппликацию на переживающие срезы мозга
3,5-дигидроксифенилглицина (DHPG) — селективного агониста метаботропных глутаматных рецепторов I группы [10]. Результаты этих исследований позволили сделать предположение, что перенесенная на 14—16-е сут пренатального развития гипоксия изменяет баланс двух конститутивных сигнальных путей, индуцируемых активностью мета-ботропных глутаматных рецепторов I группы (инозиттрифосфатного и диацил-глицерольного) и приводит к усилению механизмов входа экстраклеточного Са2+ по сравнению с механизмами его высвобождения из внутриклеточных депо. Было также показано, что перенесенная на 14-16-е сут пренатального развития гипоксия повышает базальный уровень трифосфоинозитидов в коре головного мозга и вызывает более значительное повышение содержания инозитфосфатов в ответ на аппликации глутамата в постнатальном развитии по сравнению с контрольными животными [11].
Существенную роль в формировании защитных реакций мозга при гипоксии играют антиоксидант-ные системы. Имеющиеся в настоящее время данные показывают, что механизм этих защитных реакций включает эффекты гипоксии на уровень экспрессии антиоксидантных белков. Один из ключевых эндогенных антиоксидантов — цитозоль-ный тиоредоксин-1 (Trx-1), представляющий собой небольшой (около 12 кДа) полифункциональный убиквитинилированный белок. Благодаря консервативной последовательности -Cys-Gly-Pro-Cys-своего активного центра он обладает дисульфид-дитиольной восстановительной активностью [12, 13]. Trx-1 защищает клетки от окислительного стресса [14—16]. Различные формы гипоксии/ишемии обычно повышают экспрессию Trx-1 [17—19], однако при особо тяжелых гипоксических воздействиях может, напротив, наблюдаться ее подавление. Например, экспрессия тиоредоксина и его мРНК была снижена в зоне ишемического ядра, но при этом повышена в прилежащих к нему перифо-кальных областях спустя 4 ч после фокальной ишемии мозга [20—22]. Также нами ранее была показана возможность снижения экспрессии Trx-1, напротив, в ответ на умеренные, адаптивные формы гипоксии [23].
Задачей настоящей работы было исследование влияния тяжелой гипобарической гипоксии, перенесенной беременными самками крыс линии Ви-стар, на уровень экспрессии тиоредоксина-1 в нейронах гиппокампа их потомков разного возраста.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Беременные самки крыс линии Вистар (крысы выращены в питомнике Института физиологии им. И.П. Павлова РАН) подвергались трехкратному воздействию тяжелой гипобарической гипоксии при давлении 180 мм рт. ст. (что соответствует подъему на высоту 11000 м или 5% содержанию кисло-
Стандартные режимы подъема крыс в барокамере
Давление (мм Hg) Продолжительность пребывания при данном давлении (мин) Время достижения давления от начала подъема (мин)
660 1 —
560 2 1
460 3 3
360 5 6
260 5 11
240 2 16
220 2 18
200 5 20
180 - 25
рода при нормобарической гипоксии) по 3 ч на 14-е, 15-е и 16-е сут беременности. Гипобарическая гипоксия осуществлялась в барокамере проточного типа при температуре от 20 до 25°С [24]. В таблице представлен стандартный режим подъема экспериментальных животных.
Высота 11000 м была выбрана нами как критическая (смертность взрослых крыс самцов за 3 ч пребывания в барокамере составляла 50% [25]). Смертность беременных самок была значительно ниже и составляла в среднем 15%.
Из числа родившихся крысят, перенесших гипоксию на 14-16-е сут пренатального развития, выделялись три экспериментальные группы по 6 животных в каждой. Первая исследовалась на третий день постнатального онтогенеза, вторая - на четырнадцатый и третья — по достижении взрослого возраста (80—90 сут). В качестве контроля к каждой из трех групп использовались крысы такого же возраста, не подвергавшиеся действию пренатальной гипоксии.
Уровень экспрессии Trx-1 определяли в структурах гиппокампа иммуноцитохимическим методом. Для проведения иммуноцитохимического анализа анестезированных животных перфузировали тран-скардиально сначала 100 мл физиологического раствора, затем в течение 4—5 мин — 4%-ным раствором параформальдегида в 0.1 M фосфатном буфере (PBS; pH 7.3). После окончания перфузии животных декапитировали, мозг извлекали и в течение 60 мин фиксировали тем же фиксатором. До начала анализа образцы мозга хранили в 15%-ном растворе сахарозы в фосфатном буфере PBS при температуре +4°С. Перед началом анализа с целью криопротек-ции ткани образцы в течение нескольких суток
2 ч о
¡3° «
о м м
140 130 120 110 100 90 80 70 60
Trx-1
Nt (пренатальная гипоксия на 14-16-е сутки гестации)
CA1 CA2 CA3 DG □ 3-сут и 14-сут □ 90-сут
Рис. 1. Изменения общего числа Тгх-1-иммунореак-тивных клеток (N1) в различных образованиях гиппо-кампа (СА1, СА2, СА3, аммоновом роге —DG) у 3-, 14- и 90-суточных крыс, перенесших тяжелую гипо-барическую гипоксию на 14-16-е сут гестации, в процентах к контролю. Статистическая достоверность (*Р < 0.05; **Р < 0.01) по сравнению с контролем.
выдерживали в смеси (1 : 1) 20% сахарозы в PBS и Tissue-Tek.
Ткань замораживали в Tissue-Tek(r) O.C.T™ Compound (Sakura Finetek) и немедленно с помощью криоката при температуре -20°C делали фронтальные срезы мозга толщиной 11 мк на уровне гип-покампа и базо-латеральной миндалины (примерно -2.80 мм от линии bregma [26]). Срезы помещали на предметные стекла, покрытые поли^-лизином (Sigma) и в течение 15 мин преинкубировали в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA, Boehringer Mannheim GmbH). Затем в течение ночи инкубировали с первичными поликло-нальными аффинно-очищенными кроличьими антителами к Trx-1 мыши [16] (разведение 1 : 500 в фосфатном буфере PBS, содержащем 1% BSA и 0.3% Triton X-100) при +4°С. Затем после трехкратной промывки в фосфатном буфере (по 15 мин каждая), срезы инкубировали с биотинилированными козьими вторичными антителами (Vëctor Labs, разведение 1 : 300) в течение 30 мин при комнатной температуре. После повторной трехкратной промывки в фосфатном буфере срезы в течение 30 мин инкубировали с авидин-биотиновым комплексом (Vector Labs) при комнатной температуре. Для визуализации иммун
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.