ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 1, с. 101-107
УДК 577.19.591.21
ВЛИЯНИЕ ПРИЕМА МАЛЫХ ДОЗ ЭФИРНЫХ МАСЕЛ НА АНТИОКСИДАНТНЫЙ СТАТУС ЭРИТРОЦИТОВ ПЕЧЕНИ И МОЗГА МЫШЕЙ
© 2014 г. Т. А. Мишарина, Л. Д. Фаткуллина, Е. С. Алинкина, А. И. Козаченко, Л. Г. Наглер,
И. Б. Медведева, А. Н. Голощапов, Е. Б. Бурлакова
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва 119334
e-mail: tmish@rambler.ru Поступила в редакцию 15.07.2013 г.
Проведено изучение влияния эфирных масел орегано, гвоздики и смеси эфирного масла лимона и экстракта имбиря на антиоксидантный статус органов интактных мышей (3 опытных группы) линии Balb/c. Показано, что эфирные масла, принимаемые мышами в течение 6 мес даже в очень малых дозах (300 нг/сут), проявляли себя in vivo как эффективные биоантиоксиданты. Все изученные ЭМ снижали интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембранах эритроцитов, что приводило к увеличению устойчивости мембран к спонтанному гемолизу, снижению их микровязкости, сохранению структурной целостности и функциональной активности. Эфирные масла существенно снижали интенсивность ПОЛ в печени и мозге мышей, увеличивали устойчивость липидов печени и мозга к окислению и повышали активность антиоксидантных ферментов печени. Самым активным биоантиоксидантным действием на эритроциты обладало эфирное масло гвоздики, на печень и мозг — смесь эфирного масла лимона с экстрактом имбиря.
Б01: 10.7868/80555109914010097
Процессы свободнорадикального окисления играют важнейшую роль в жизнедеятельности всех живых организмов. В физиологических условиях они контролируются сложной многоуровневой системой эндогенных антиоксидантов и антиоксидантных ферментов [1, 2]. Было показано, что антиоксиданты являются универсальными модификаторами состава, структуры и функциональной активности мембран и многие закономерности их влияния на клеточный метаболизм могут быть объяснены с этих позиций [3—5]. Существующие неблагоприятные факторы окружающей среды, развитие патологических процессов в организме приводят к нарушению отдельных звеньев этой отлаженной системы и к развитию окислительного стресса [6]. Для снижения и предотвращения его последствий используют дополнительные экзогенные антиоксиданты, среди которых интересными и перспективными являются эфирные масла (ЭМ) пряно-ароматических растений, употребляемых в пищу [7, 8].
Применение антиоксидантов в биологических объектах требует проведения специальных исследований их роли и механизма действия [9]. Изучение таких процессов является крайне сложной задачей. В настоящее время нет ни одного метода, позволяющего выявить реальный механизм действия даже индивидуального антиоксиданта в
биологических объектах и тем более — смесей веществ с различными антиоксидантными свойствами [9—11]. Как следует из литературных данных, исследований биоантиоксидантного (БАО) действия ЭМ в живых организмах in vivo крайне мало [9, 12, 13]. Сложность изучения БАО свойств ЭМ in vivo связана с многокомпонентностью их состава. Компоненты ЭМ обладают различными химическими и биологическими свойствами, начиная с различий по скорости всасывания, транспорта, экскреции, способности к проникновению и накоплению в клетке и заканчивая их непосредственным влиянием на окислительный стресс в различных клеточных компартментах. С одной стороны, это недостаток, с другой — преимущество, так как по сравнению с индивидуальным веществом, многокомпонентный препарат имеет сразу несколько активных соединений, которые могут действовать по нескольким различающимся механизмам и усиливать активность друг друга.
Цель работы — изучение in vivo влияния эфирных масел гвоздики, орегано и смеси эфирного масла лимона и экстракта имбиря, принимаемых мышами в малых дозах с питьевой водой в течение 6 мес, на показатели окислительного стресса в эритроцитах, печени и мозге.
МЕТОДИКА
В работе использовали ЭМ из листьев и цветов растения орегано (Origanum vulgare L.) (компания "Lionel Hitchen Ltd", Великобритания), из почек гвоздики (Caryophyllus aromaticus L.), из кожуры лимона (Citrus limon L.) и экстракт имбиря (Zingiber officinale R.) (компания "Plant Lipids Ltd.", Индия).
Эксперименты in vivo проводили на самках мышей линии Balb/c. Животных брали из питомника ("Столбовая", Московская обл.) в возрасте 2 мес массой 18—21 г, размещали по 8—10 особей в клетках из нержавеющей стали размером 220 x x 320 x 500 мм и в течение последующих экспериментов содержали на общевиварном рационе (рецепт ПК120 ООО "Лабораторкорм", Москва) при 20—22°С и естественном освещении. Все мыши были разделены на 4 группы, контрольная группа (37 мышей) получала чистую питьевую воду ad libitum. Животные трех экспериментальных групп на протяжении всего эксперимента употребляли питьевую воду с добавлением ЭМ орегано (37 мышей), гвоздики (37 мышей) или смеси (1 : 1) ЭМ лимона и экстракта имбиря (39 мышей). Для этого в 100 мл водно-спиртовой (10 : 1) смеси растворяли по 30 мг одного из ЭМ или по 15 мг экстракта имбиря и ЭМ лимона. Полученные растворы хранили в холодильнике при 5°C и добавляли в питьевую воду из расчета 0.5 мл на 1 л воды. Воду с добавлением эфирных масел готовили непосредственно перед заполнением поилок два раза в 1 нед. Такие конечные растворы содержали по 150 нг/мл эфирных масел. Учитывая, что каждая мышь в 1 сут. выпивала около 2 мл воды, суточная доза эфирных масел составляла около 300 нг. Через б мес. приема ЭМ у 5 мышей из каждой группы отбирали кровь, мозг и печень для биохимических исследований.
Определение степени спонтанного гемолиза эритроцитов. Определение проводили по методике, описанной в работе [14], на спектрофотометре СФ-2000 ("ОКБ Спектр", Россия).
Определение содержания активных продуктов (АП) реакции тиобарбитуровой кислоты (ТБК) с малоновым диальдегидом и другими продуктами
ПОЛ. Определение этого показателя в мембранах эритроцитов проводили в тех же пробах, что и гемолиз спектрофотометрически по методике, приведенной в работе [15]. Содержание ТБК-АП определяли спектрофотометрически в свежепо-лученных и хранившихся при 2—5°C в течение 3— 7 сут печени и мозге мышей по методике, описанной в работе [1б].
Определение микровязкости мембран эритроцитов. Микровязкость определяли методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) с использованием двух парамагнитных зондов, локализующихся в поверхностном слое липидов мембран на разной глубине [17, 18]: 2,2,б,б-тетраметил-4-ка-прилоилоксилпиперидин-1-оксил (зонд 1) и 5,б-
бензо-2,2,6,6-тетра-метил-1,2,3,4-тетрагидро-у-карболин-3-оксил (зонд 2). Время вращательной корреляции зондов тс имеет значение промежутка времени, за который спин радикала успевает переориентироваться на угол я/2 и характеризует микровязкость компонентов мембраны [18, 19].
Определение активности антиоксидантных ферментов. Активность ферментов печени суперок-сиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГП) и глутатион^-трансферазы (ГТ) определяли в го-могенате печени мышей по методикам, приведенным в работе [20]. Активность ферментов ГП и ГТ измеряли в международных единицах (ед./мг белка, в скобках удельная активность). За одну единицу активности принимали количество фермента, которое превращает 1 мкмоль субстрата за 1 мин. Для СОД определяли количество образца в 1 мл, вызывающее 50%-ное ингибирование ксанти-ноксидазной реакции в стандартных условиях, и относили к 1 мг белка [20]. Активность ферментов в опытных образцах выражали по отношению к активности контрольного образца, который принимали за 100%.
Математическую обработку результатов осуществляли с помощью программ Microsoft Excel 2007 и Sigma Plot 10. Стандартное отклонение средних величин из 3 измерений не превышало 5—8% (относительные).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для исследования биологической активности ЭМ в экспериментах на животных мы выбрали те, которые имели высокую и очень высокую антирадикальную активность в реакции со свободным стабильным дифенилпикрилгидразил-радикалом [24, 22]. Это были ЭМ гвоздики и орегано, а также смесь ЭМ лимона и экстракта имбиря, такое сочетание используют в народной медицине для профилактики и лечения некоторых видов заболеваний. Основной целью наших исследований была оценка влияния систематического приема малых доз ЭМ на антиоксидантный статус органов мышей. Из трех масел самым изученным было ЭМ орегано. Так, ранее было показано, что это масло в модельной системе эффективно ингиби-ровало окисление полиненасыщенных жирных кислот, выделенных из липидов мозга мышей [23]. Его постоянный прием в малых дозах увеличивал среднюю и максимальную продолжительность жизни мышей, сохранял на высоком уровне содержание полиненасыщенных жирных кислот в мозге стареющих и очень старых мышей, т.е. ЭМ проявляло свойства биоантиоксиданта [24]. Следует отметить, что ЭМ орегано, близкое по составу компонентов с ЭМ чабера и тимьяна, различающихся соотношением и общей концентрацией фенолов — карвакрола и тимола, имело также
Таблица 1. Биохимические показатели эритроцитов, печени и мозга мышей, употреблявших эфирные масла в течение 6 мес.
Значение показателя, % от контроля
Показатель контроль ЭМ орегано ЭМ гвоздики ЭМ лимона + + экстракт имбиря
Степень гемолиза эритроцитов, % 100.0 ± 6.8 85.0 ± 6.2 66.3 ± 6.9 91.7 ± 6.1
Микровязкость поверхностных липидов эритроцитов, тс 10-10 с 0.32 ± 0.02 (100%) 0.25 ± 0.03 (78%) 0.22 ± 0.02 (69%) 0.32 ± 0.03 (100%)
Микровязкость прибелковых липидов эритроцитов, тс 10-10 с 1.22 ± 0.08 (100%) 1.12 ± 0.07 (92%) 1.14 ± 0.05 (93%) 1.23 ± 0.07 (101%)
ТБК-АП эритроцитов, мкмоль/л эритроцитарной массы 14.14 ± 1.62 (100%) 10.77 ± 0.40 (76%) 8.25 ± 0.37 (59%) 11.00 ± 0.38 (78%)
ТБК-АП в печени, нмоль/г ткани 0 сут 3.14 ± 0.23 (100%) 2.95 ± 0.20 (94%) 2.23 ± 0.19 (71%) 1.92 ± 0.16 (61%)
через 7 сут 11.21 ± 0.36 (357%)* 7.12 ± 0.23 (241%)* 4.85 ± 0.20 (223%)* 3.26 ± 0.18 (170%)*
ТБК-АП в мозге, нмоль/г ткани 0 сут 1.72 ± 0.24 (100%) 1.58 ± 0.15 (92%) 1.30 ± 0.10 (75%) 1.22 ± 0.12 (71%)
через 3 сут 3.72 ± 0.39 (216%)* 1.89 ± 0.34 (120%)* 2.92 ± 0.38 (225%)* 2.52 ± 0.32 (207%)*
* Содержание ТБК-АП в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.