ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 45, № 1, с. 84-91
УДК 579.25;579.262;579.64
ВЛИЯНИЕ ПРИРОДНЫХ И ГИБРИДНЫХ ЛЕКТИНОВ НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ С РИЗОБИЯМИ
© 2009 г. Ал. X. Баймиев, И. И. Губайдуллин, Ан. X. Баймиев, А. В. Чемерис
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Уфа, 450054; e-mail: alex@anrb.ru Поступила в редакцию 17.09.2007 г.
Исследовано влияние гибридных лектинов, представляющих собой полноразмерный лектин гороха Pisum sativum (PSL) с углеводсвязывающим участком, замещенным на таковые лектинов донника белого Melilotus albus (PSL/MAL) и астрагала солодколистного Astragalus glycyphyllos (PSL/AGL), на симбиоз бобовых растений с ризобиями. Обработка лектином гороха PSL ризобий R. leguminosarum bv. viciae в ризосфере люцерны Medicago sativa привела к формированию на корнях данного растения неинфици-рованных псевдоклубеньков, в то время как обработка гибридным лектином PSL/AGL вызвала у бактерий из клубеньков Astragalus cicer способность образовывать на люцерне инфицированные клубеньки. Данный результат связывается с расширенными и необычными для лектинов бобовых растений (совмещенная специфичность к Gal и Glc) углеводсвязывающими характеристиками этого гибридного белка.
Еще в 1974 г. было обнаружено, что бактерии рода Rhizobium способны связывать лектины растений, с которыми они вступают в симбиотические взаимоотношения [1]. В дальнейшем было проведено множество исследований, касающихся возможности участия лектинов бобовых растений в первичном взаимодействии микро- и макросимбионтов. Весьма убедительное доказательство участия лектина в инициировании симбиотического клу-бенькообразования представили Диаз с соавт. [2]. Ими было показано, что введение гена лектина гороха посевного в геном клевера белого, вступающего в симбиоз исключительно с клубеньковыми бактериями R. leguminosarum bv. trifolii, делает возможными неспецифическую инфекцию и клубень-кообразование на корневых волосках трансгенного растения симбионтом гороха R. leguminosarum bv. viciae. Необходимость экспрессии гена лектина гороха для такой гетерологичной инфекции доказывается также экспериментами по заменам аминокислот в углеводсвязывающем пептиде кодируемого им белка. Так, замена Asn на Asp в позиции 125 (подавление углеводсвязывающей активности белка) элиминировала, а замена Ala на Val в позиции 126 (изменение углеводсвязывающей активности белка) заметно уменьшала число растений клевера, инфицированных клубеньковыми бактериями гороха при неизменно высоком проценте заражаемости собственными ризобиями [3].
Однако процедура генетической трансформации бобовых растений представляет собой достаточно трудоемкий процесс. Один из вариантов решения данной проблемы заключается в изучении симбиотической роли лектинов путем экзогенной обработки ими растений и микроорганизмов.
Удобным инструментом для исследования роли лектинов в бобово-ризобиальном симбиозе являются белки, полученные с применением прокарио-тических экспрессионных систем. Такие системы позволяют нарабатывать сконструированные гибридные лектины с заданными свойствами для изучения функционально значимых углеводсвязываю-щих областей, определяющих возможность формирования бобово-ризобиальных отношений.
Опираясь на знания о структурно-функциональных особенностях лектинов бобовых, нами созданы гибридные конструкции, кодирующие полноразмерный лектин гороха Pisum sativum (PSL) с углеводсвязывающим участком, замещенным на таковые лектинов растений донника белого Melilotus albus (PSL/MAL) и астрагала солодколистного Astragalus glycyphyllos (PSL/AGL). Последовательности генов данных гибридных белков депонированы в международные банки данных GenBank/EMBL/ DDBJ под регистрационными номерами DQ319002 и DQ319003 соответственно.
Исследование углеводсвязывающих свойств гибридов показало изменение их специфичности к простым сахарам, а у PSL/AGL обнаружена совмещенная специфичность к Gal и Glc, нехарактерная для лектинов бобовых [4]. Таким образом, можно ожидать, что данные белки изменили и другие свои физиологические свойства.
Цель работы - изучение симбиотических функций сконструированных нами химерных лектинов.
МЕТОДИКА
Растения. В работе использовали следующие бобовые растения: люцерна посевная (Medicago sativa),
астрагал нутовый (Astragalus cicer) и козлятник восточный (Galega orientalis). Поверхность семян стерилизовали 4 мин в концентрированной серной кислоте, затем многократно промывали стерильной водопроводной водой и проращивали в чашках Петри в стерильных условиях. Бактериями обрабатывали 2-суточные проростки люцерны, 4 и 6 сут козлятника и астрагала соответственно.
Бактерии. Растения инокулировали штаммами клубеньковых бактерий R. galegae bv. orientalis CIAM 0702 из коллекции микроорганизмов ВНИИСХМ РАСХН (С.-Петербург), а также R. le-guminosarum bv. viciae из клубеньков мышиного горошка; Sinorhizobium meliloti, из клубеньков донника белого и клубеньковыми бактериями Astragalus cicer из собранной нами коллекции ризобий бобовых растений одного ареала произрастания. Видовую принадлежность бактерий определяли секвени-рованием генов 16S рРНК. Зарегистрированная нами в международных базах EMBL/GenBank/DDBJ под номером DQ372662 последовательность гена 16S рРНК ризобий, высеянных из клубеньков A. cicer, оказалась идентичной таковой Agrobacterium tumefa-ciens, штамм IAM 14 (GenBank accession no. D13294).
Ризобии выращивали на среде TY (%): дрожжевой экстракт - 0.1, бакто-триптон - 1, CaCl2 - 0.1 в течение 2 сут при 28°С до оптической плотности D600 1.5.
Белки. Для экзогенной обработки использовали: лектин гороха посевного (PSL); лектин козлятника восточного (GOL); гибридный лектин гороха с угле-водсвязывающим участком лектина донника белого (PSL/MAL) и гибридный лектин гороха с углеводсвя-зывающим участком лектина астрагала солодко-листного (PSL/AGL) (идентичного лектину астрагала нутового). Белки нарабатывали в клетках E. coli штамма BL21trxB(DE3)pLysS, трансформированных плазмидой pET-15b с клонированными генами лектина. Лектин выделяли аффинной хроматографией на никелевых колонках HisTrap ("Amersham Biosciences", США) по протоколу фирмы-изготовителя.
Обработка лектинами ризобий в ризосфере бобового растения. В стерильные пробирки вносили по 100 мкл суспензии клубеньковых бактерий и добавляли раствор лектина до конечной концентрации 10 мкг/мл. Затем в них помещали стерильные 2-6 сут проростки так, чтобы их корни оказались погруженными в жидкость. Растения в закрытых пробирках инкубировали в течение 15 ч при 28°С. После инкубации проростки с инокулятом пересаживались в стаканчики со стерилизованным вермикулитом, насыщенным солями раствора Хогланда-Арнона.
Схема постановки опытов представлена в таблице. На каждую серию опытов с определенным растением были поставлены по 3 контроля. Первый -на спонтанное образование клубеньков и контаминацию. В данном варианте вместо суспензии бакте-
рий в пробирку добавляли стерильную среду TY. Второй - на нодуляцию своим штаммом без лектина: M. sativa - S. meliloti, A. cicer - клубеньковые бактерии A. cicer и G. orientalis - R. galegae bv. orientalis. Третий - на нодуляцию смесью гетерологичных штаммов без лектина. Во все контрольные варианты вместо лектина в пробирки добавляли элюат белковой фракции клеток E. coli без гена лектина.
Через 20 и 40 сут корневая система растений была проанализирована на наличие ответных реакций. Анализ проводили с помощью светового микроскопа.
Идентификация клубёнекобразующего штамма.
Клубеньки многократно отмывали в водопроводной воде, затем стерилизовали их поверхность последовательно 10 мин в 70%-ном этаноле и 10 мин в 10%-ном гипохлорите натрия. Затем многократно промывали стерильной водопроводной водой. Клубенек раздавливали и разрушали до гомогенного состояния пинцетом в микропробирке в 20 мкл среды TY с соблюдением условий стерильности. Затем суспензию центрифугировали при 1000 g 5-10 с и су-пернатант рассевали на чашки Петри со средой TY. Бактериальную ДНК из выросших колоний для ПЦР выделяли гуанидиновым методом с использованием сорбентов. Анализ RAPD проводили на ам-плификаторе МС2 Терцик компании "ДНК-технология" (Россия) с использованием "произвольного" праймера 5'-CAGGCCCTTC-3' и стандартных наборов для амплификации ДНК.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Экзогенная обработка лектинами бактерий в ризосфере бобовых растений. Для оценки влияния лектина на развитие бобово-ризобиального симбиоза были поставлены различные варианты опытов с инокуляцией растений астрагала нутового, козлятника восточного и люцерны посевной ризобия-ми люцерны (донника), гороха, козлятника восточного и астрагала нутового при обработке их природными PSL, GOL и гибридными лектинами PSL/MAL, PSL/AGL (таблица).
Выбор люцерны посевной в качестве объекта исследований обусловлен высокой клубенекобра-зующей активностью этого растения. Известно, что некоторые линии люцерны формируют в стерильных условиях псевдоклубеньки, близкие по структуре к нормальным, возникающим при инокуляции растений штаммами S. meliloti [5]. Козлятник восточный, наоборот, не склонен к формированию псевдоклубеньков и характеризуется строгой специфичностью к своему симбиотическому партнеру -R. galegae bv. orientalis [6].
Бактерии, кроме ризобий козлятника, были собраны из клубеньков донника, мышиного горошка и астрагала, произраставших совместно на территории около 1 м2. Сделано это было из следующих сотом 45 < 1 2009
Варианты и результаты обработки растений ризобиями и лектинами
№ Инокулируемое Ризобии (инокулят) Лектин Фенотипические ответы рас-
опыта растение тения
1 Galega orientalis R. galegae bv. orientalis CIAM 0702 - розовые клубеньки с бактериями (до 40)
2 » - - видимых проявлений нет
3 » смесь: R. leguminosarum bv. viciae, S. meliloti и бактерии из A. cicer - видимых проявлений нет
4 » R. leguminosarum bv. viciae PSL скручивания корней (до 5)
5 » S. meliloti PSL/MAL видимых проявлений нет
6 » бактерии из клубеньков Astragalus cicer PSL/AGL скручивания корней (до 7)
7 Astragalus cicer бактерии из клубенько
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.