БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2013, том 30, № 1, с. 21-29
УДК 577.48+591.112+ 616.14+637.146.1
ВЛИЯНИЕ ПРОБИОТИКОВ И ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРОДУКТА НА ЭНЕРГЕТИКУ МИТОХОНДРИЙ И ДИНАМИКУ КАЛЬЦИЕВОГО СИГНАЛА В КЛЕТКАХ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ
© 2013 г. К. В. Соболь*, С. М. Коротков, Г. Б. Белостоцкая, В. П. Нестеров
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, 194223, Санкт-Петербург, просп. М. Тореза, 44; *электронная почта: sobol_cv@yahoo.com Поступила в редакцию 16.04.2012 г.
Исследовано влияние лактобактерий и нового пробиотического продукта на энергетику митохондрий сердца крысы и динамику кальциевого сигнала кардиомиоцитов и гладкомышечных клеток аорты крысы. Скорость дыхания изолированных митохондрий оценивали полярографическим методом. [Са2+] регистрировали при помощи флуоресцентного зонда Fura 2 AM и компьютерной системы анализа внутриклеточного содержания ионов (Intracellular Imaging & Photometry System, США). Показано, что аппликация лактобактерий в концентрации 5 х 107 КОЕ повышала [Са2+] в кардиомиоцитах, что может свидетельствовать о способности лактобактерий увеличивать силу сердечных сокращений. С другой стороны, аппликация лактобактерий снижала тапсигаргин-индуци-рованный вход кальция в гладкомышечных клетках аорты крысы, что может указывать на определенный гипотензивный эффект лактобактерий. Установлено, что пробиотический продукт стимулирует дыхание, а также вызывает легкое разобщение электронного транспорта и окислительного фосфорилирования в митохондриях сердца крысы. В клетках сердца и гладкомышечных клетках сосудов пробиотический продукт повышает уровень [Са2+]ь что может приводить к увеличению сократительной активности как кровеносных сосудов, так и сердца. Предполагается, что пробиотический продукт может эффективно применяться при эндотоксическом шоке в условиях, когда снижается сократительная реакция сосудов на действие вазоактивных веществ.
Ключевые слова: кальций, кардиомиоциты, гладкие мышцы сосудов, митохондрии, пробиотики, лактобактерии.
Б01: 10.7868/80233475512060072
Человек находится в состоянии постоянного симбиоза с микроорганизмами. Непатогенные микробные ассоциации участвуют в выполнении жизненно важных функций макроорганизма и в поддержании его гомеостаза. Они оказывают морфокинетическое влияние, участвуют в обмене веществ и продуцируют биологически активные соединения [1], включая такие важнейшие ней-ромедиаторы, как глутаминовая и у-аминомасля-ная кислоты. Недавно обнаружили, что кишечные бактерии и продукты их метаболизма могут оказывать существенное влияние на развитие головного мозга и поведение млекопитающих [2].
Индигенная микрофлора, колонизирующая соприкасающиеся с внешней средой органы, включая кишечник, отделена от внутренней среды макроорганизма соответствующими барьерами. Однако продукты жизнедеятельности нашей микрофлоры в желудочно-кишечном тракте могут достаточно легко проникать в кровь и тем са-
мым влиять на физиологические процессы, протекающие в макроорганизме. Под действием неблагоприятных факторов (стресс, шок, нарушения гемодинамики, эндотоксемия и др.) возрастает проницаемость слизистых кишечника для инди-генной микрофлоры [3, 4], важным компонентом которой являются молочнокислые бактерии рода Lactobacillus [5]. Некоторые авторы рассматривают хроническую сердечную недостаточность в комплексе с нарушениями желудочно-кишечного тракта [3]. Однако при приеме с пищей лактобак-терии и продукты их метаболизма положительно влияют на сердечно-сосудистую систему. Лакто-бактерии могут вырабатывать биологически активные пептиды, ингибирующие ангиотензин-превращающий фермент, и, возможно, участвовать в предотвращении некоторых сердечно-сосудистых заболеваний, например, гипертензии [6, 7]. Пробиотики могут снижать повышенное артериальное давление, продуцируя ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента [7]. По-
казано, что прием гидролизатов белков молока и/или ферментированных молочных продуктов, содержащих пептиды-ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, приводит к снижению артериального давления [8—10]. Лактобакте-рии участвуют также в регуляции уровня холестерина [11, 12] и могут снижать уровень окисленных форм липопротеинов низкой плотности [13], уменьшая опасность сердечно--сосудистых осложнений. Более того, прием пробиотиков и продуктов их метаболизма улучшает состояние и барьерную функцию желудочно-кишечного тракта, снижая вероятность осложнений у больных хронической сердечной недостаточностью [3]. Пробиотики и продукты на их основе уже достаточно широко внедрены в клиническую практику. Применение пробиотиков в отделениях интенсивной терапии способствовало повышению иммунитета, снижению смертности, а также частоты диареи и сепсиса [14]. Для усиления терапевтического эффекта создан новый пробиотический продукт (ПП) с повышенным содержанием метаболитов пробио-тических бактерий [15], характеризующийся выраженной первичной фармакологической реакцией [16].
Однако непосредственное влияние лактобак-терий и/или продуктов их метаболизма на клетки сердечно-сосудистой системы in vitro не изучено. Эти исследования важны для понимания механизмов влияния нашей микрофлоры на сердечно-сосудистую систему, ее функции и регуляцию в норме и при патологии (сепсисе). Это тем более актуально, что, по всей видимости, на развитие сердечно-сосудистых заболеваний влияют различия в метаболизме питательных веществ, осуществляемом кишечной микрофлорой [17].
Чтобы выяснить, как влияет наша микрофлора на клетки сердечно-сосудистой системы, мы изучали влияние лактобактерий и ПП на энергетику митохондрий сердца крысы, а также на динамику кальциевого сигнала кардиомиоцитов и гладко-мышечных клеток (ГМК) аорты крысы.
Показано, что аппликация лактобактерий в концентрации 5 х 107 КОЕ увеличивала [Са2+] в кардиомиоцитах, однако снижала индуцированный тапсигаргином вход кальция в гладкомы-шечных клетках аорты крысы.
Установлено, что ПП стимулирует базальное дыхание, а также вызывает легкое разобщение электронного транспорта и окислительного фос-форилирования в митохондриях сердца крысы. В клетках сердца и гладкомышечных клетках сосудов ПП увеличивает уровень [Са2+];.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для выделения митохондрий использовали самцов крыс линии Wistar весом 200—250 г. Мито-
хондрии сердца крысы (МСК) выделяли согласно [18]. Концентрация белка в препаратах митохондрий, определенная по методу Бредфорд, составила 20—30 мг/мл. Скорость дыхания митохондрий (нг-атом О/мин • мг белка) оценивали полярографическим методом с использованием закрытого платинового электрода типа Кларка на анализаторе Эксперт-001 (НПО Эконикс эксперт, Москва, Россия) при 26°С в ячейке объемом 1.5 мл, в среде, содержащей 125 мМ KCl, 20 мМ трис-MOPS (pH 7.3), 3 мМ трис-Р04, 0.05 мМ EGTA, 10 мМ глутамат и 2 мМ малат. Дыхание измеряли при концентрации митохондриального белка, равной 1 мг/1 мл среды инкубации.
Выделение кардиомиоцитов и гладкомышечных клеток аорты. Для получения клеточного материала 20-40-дневных крыс линии Wistar усыпляли при помощи углекислого газа. Для выделения кардиомиоцитов сердца измельчали и инкубировали при 37°С в течение 40—50 мин в растворе Рингера: 146 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 11 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES (pH 7.4), содержащем коллагеназу типа IA (1 мг/мл, Sigma) и трипсин (0.12%, Биолот, Россия). После фильтрации и центрифугирования клетки переносили в питательную среду DMEM (Биолот, Россия) с 10% эмбриональной сыворотки (Биолот, Россия) и антибиотиками (пенициллин (50 ед./мл)/стреп-томицин (50 мкг/мл)). Немышечные клетки удаляли предварительной инкубацией на стеклянных чашках Петри в течение 40—50 мин при 37°С. Затем неприкрепившиеся клетки инкубировали на полосках покровных стекол (12 ± 24 мм), покрытых поли-^-лизином (0.1 мг/мл, MP Biomedicals).
ГМК выделяли из кусочков аорты крыс 20— 40-дневного возраста. Фрагменты аорты промывали в среде DMEM/F12, измельчали и инкубировали в среде DMEM/F12 с коллагеназой типа IV (1 мг/мл, Sigma) и эластазой III (1 мг/мл, Sigma) в течение 20—30 мин при 37°С. Полученные клетки инкубировали в среде DMEM/F12 с 10% эмбриональной сыворотки (Биолот, Россия) и антибиотиками (пенициллин (50 ед/мл), стрептомицин (50 мкг/мл) на полосках покровных стекол, покрытых поли-^-лизином (0.1 мг/мл, MP Biomedicals). Опыты проводили на кардиомиоцитах и ГМК, культивируемых в течение 5—8 дней в СО2-инкубаторе (Jouan, Франция) при 5% СО2, влажности 95% и температуре 37°С.
Для идентификации ГМК применяли окрашивание флуоресцентным красителем родамин-фаллоидином (Sigma) — возбуждение при 543 нм, эмиссия при 580—650 нм. Клетки, выращенные на покровных стеклах, фиксировали 2.5% пара-формальдегидом в растворе Рингера в течение 10 мин и отмывали 3 раза по 5 мин. Для пермеаби-лизации клетки инкубировали в течение 10 мин в
растворе Рингера с добавлением 0.25% тритона X-100. После удаления тритона X-100 клетки инкубировали с родамин-фаллоидином (10 мкг/мл) в течение 1 ч, а затем отмывали в физиологическом растворе (3 раза по 5 мин).
Для измерения внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция, [Ca2+]¡, стекла с клетками инкубировали в растворе Рингера с флуоресцентным красителем Fura 2 AM (Sigma) в концентрации 5 мкмоль/л в течение 1 ч при 26° С. Затем клетки отмывали раствором Рингера в течение 30 мин. и измеряли [Ca2+]i при комнатной температуре.
[Ca2+]i регистрировали с помощью компьютерной системы по внутриклеточному анализу изображений и фотометрии (Intracellular Imaging & Photometry System, США), включающей инвертированный микроскоп Nikon TMS (х30) с монохромной цифровой видеокамерой RS-170 CCD (Cohu), компьютер и программное обеспечение. Возбуждение образца осуществляли при 340 и 380 нм, а эмиссию регистрировали при 510 нм. Встроенная программа InCytIm2TM позволяла рассчитывать концентрацию кальция как соотношение интенсивностей флуоресценции при 340 и 380 нм (F340/F380) с учетом калибровочной кривой. Калибровочную кривую строили по растворам с определенными концентрациями кальция, полученным из Fluka Chemicals.
ПП получали мет
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.