МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2012, том 46, № 4, с. 644-653
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.21;577.214.3;578.821
Посвящаем памяти Леона Владимировича Бакиновского
ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ДЕЗОКСИНОИРИМИЦИНА НА МОРФОГЕНЕЗ ВИРУСА ГЕПАТИТА С
© 2012 г. А. В. Тимохова1, |Л. В. Бакиновскийр, А. И. Зинин2, В. И. Попенко1, А. В. Иванов1, П. М. Рубцов1, С. Н. Кочетков1, С. Н. Белжеларская1*
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва 119991 2Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского Российской академии наук, Москва 119991
Поступила в редакцию 09.11.2011 г. Принята к печати 29.12.2011 г.
Вирусный гепатит С (ВГС) — одно из широко распространенных и опасных заболеваний человека. Число терапевтических средств при лечении ВГС ограничено, вакцины для его профилактики нет, поэтому большое значение имеет разработка новых антивирусных стратегий. Одной из них может быть воздействие на морфогенез вируса, что приводит к его угнетению. Поскольку важным этапом морфогенеза, предопределяющим правильную сборку вириона ВГС, является гликозилирование белков оболочки вируса в инфицированной клетке, можно предположить, что производные аналога глюкозы — дезоксиноиримицина (БШ, ингибиторы а-глюкозидазы) будут нарушать процесс сборки структурных белков и формирование частиц ВГС. В работе изучено влияние алкилированных производных БШ (К-пентил-БШ и К-бензил-БШ) на морфогенез ВГС в модельной системе — клетках насекомых, синтезирующих три вирусных структурных белка с образованием вирусоподобных частиц. В присутствии этих производных нарушается внутриклеточное К-гликозилирование оболочечных гликопротеинов ВГС. В концентрации 1 мМ производные БШ повышают содержание гликопротеинов gpE1и gpE2, их электрофоретическая подвижность уменьшается, что, по-видимому, обусловлено блокированием а-глюкозидаз в эндоплазматическом ретикулуме клетки и накоплением гипергликозилированных К-гликанов в гликопротеинах ВГС. Взаимодействие последних с кальнексином приводит к образованию непродуктивных димеров и подавляет продуктивную сборку вирусоподобных частиц.
Ключевые слова: бакуловирус AcMNPV, клетки насекомых Sf9, вирус гепатита С (ВГС), структурные белки ВГС, гликопротеины ВГС, вирусоподобные частицы ВГС, а-глюкозидазы, дезоксиноиримицин (DNJ), NBnDNJ, NPnDNJ, NBDNJ, кальнексин, кальретикулин.
AFFECT OF DEOXYNOJIRIMYCIN DERIVATIVES ON HEPATITIS C VIRUS MORPHOGENESIS by A. V. Timokhova1, L. V. Bakinovskii2f, A. I. Zinin2, V. I. Popenko1, A. V. Ivanov1, P. M. Rubtsov1, S. N. Kochetkov1, S. N. Beljelarskaya1* (1Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia,*e-mail: belj@eimb.ru; 2 Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia). Viral hepatitis C is one of the wide-spread and dangerous human diseases. The choice of drugs for treatment of chronic hepatitis C virus (HCV) infection is limited and prophylactic vaccines do not exist. Thus, the development of new antiviral strategies and substances are of great importance. The targeting of viral morphogenesis might be used as an alternative approach to existing strategies of HCV blocking. The glycosylation of viral envelope proteins is an important step of viral particle morphogenesis that determines the correct assembly of HCV virions. The derivatives of glucose analog deoxynojirimycin (DNJ) — inhibitors of a-glucosidase can impair the assembly of structural proteins and HCV particle formation. In the present work the affect of alkylated derivatives of dNj N-pentyl-DNJ and N-benzyl-DNJ to HCV morphogenesis in a model system insect cells producing three viral structural proteins with formation of virus-like particles was studied. Intracellular N-glycosylation of HCV envelope glycoproteins was shown to be impaired by DNJ derivatives. At 1 mM concentrations of these substances the level of gpE1 and gpE2 glycoproteins increase and their electro-phoretic mobility decrease which seems to be due to inhibition of a-glucosidase in endoplasmic reticulum and ac-
Принятые сокращения: ВГС — вирус гепатита С; ВПЧ — вирусоподобные частицы; ЭР — эндоплазматический ретикулум; БОЕ — бляшкообразующие единицы; DNJ (deoxynojirimycin) — дезоксиноиримицин; NBnDNJ (N-benzyl-deoxynojirimycin) — N-бензилдезоксиноиримицин; NPnDNJ (N-pentyl-deoxynojirimycin) — пентилдезоксиноиримицин; NBDNJ (N-butyl-deo-xynojirimycin) — N-бутилдезоксиноиримицин; DNJHCl — 1-deoxynojirimycin hydrochloride — дезоксиноиримицингидрохлорид.
* Эл.почта: belj@eimb.ru
cumulation of hyperglycosylated N-glycans in HCV glycoproteins. The interaction of the latters with calnexin leads to formation of unproductive dimers and bloks productive assembly of virus-like particles.
Keywords: baculovirus AcMNPV, hepatitis C virus (HCV), HCV structural proteins, HCV-like particles (VLPs), Sf9 insect cells, DNJ, NBn-DNJ, NPn-DNJ, NB-DNJ, calnexin, calreticulin.
По оценкам ВОЗ вирусом гепатита С (ВГС) инфицировано около 200 млн. человек (3% населения Земли), и инфекция продолжает распространяться [1], часто приводя к хроническому поражению печени, циррозу или злокачественному перерождению клеток печени. Смертность больных хронической формой гепатита С составляет примерно 30%. При гепатите С до сих пор используется, в основном, комбинированная терапия а-интерфероном и рибавирином, а профилактических и терапевтических вакцин нет [2, 3]. Эффективность лечения зависит от генотипа вируса, 40% пациентов не поддается лечению [2—5]. Поиски ингибиторов ВГС наталкиваются на уникальные особенности вируса, такие как высокая изменчивость, геномная вариабельность, способность к преодолению иммунного ответа. Низкая эффективность репликации вируса в культуре клеток и отсутствие подходящих животных моделей затрудняют изучение жизненного цикла вируса и блокирование инфекции [6, 7]. В настоящее время исследуются соединения, направленно действующие на вирусные ферменты, однако этот подход, основанный только на поиске ферментных мишеней, может столкнуться с проблемой устойчивости вируса. В качестве альтернативного подхода можно попытаться воздействовать на морфогенез вируса [8—14].
ВГС — единственный представитель рода Hepa-civirus — относится к семейству Flaviviridae. Его геном представлен одноцепочечной РНК длиной 9600 н. Полипротеин, синтезируемый с единственной рамки считывания, подвергается про-цессингу с образованием десяти зрелых структурных и неструктурных белков [6, 7, 15, 16]. Три структурных белка — кор-белок С (core protein) и гликопротеины оболочки, gpE1 и gpE2, — входят в состав вирионов ВГС, однако детальное строение вирусной частицы и способ ее формирования остаются недостаточно изученными [15]. Наименее изучен этап сборки вирионов и их выход из клетки. Известно, что взаимодействие структурных белков ВГС и характер их укладки влияют на свойства вирионов ВГС [17].
Упомянутые гликопротеины gpE1 и gpE2 могут либо димеризоваться при нековалентном взаимодействии в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) с образованием функциональных, предшествующих почкованию, комплексов, либо образовывать агрегаты, содержащие неправильно свернутые нефункциональные гликопротеины, посред-
ством дисульфидных мостиков. В образовании комплексов участвуют два хозяйских белка-шапе-рона, один из которых — кальнексин — взаимодействует с гликопротеинами, участвующими в образовании функциональных комплексов, а другой — кальретикулин — взаимодействует с неверно упакованными гликопротеинами, образующими агрегаты [17—21]. Посттрансляционные модификации белков происходят в ЭР и аппарате Гольджи. Один из наиболее общих типов модификации — это N-гликозилирование, при котором малораз-ветвленная олигосахаридная цепочка, состоящая из девяти остатков маннозы (Man) и трех остатков глюкозы (Glc), добавляется к специфическим остаткам аспарагина в последовательности Asn-X-Ser или Asn-X-Thr, где X — любая аминокислота, кроме пролина [22]. N-гликозилирование характерно для поверхностных белков оболочечных вирусов. Добавление олигосахарида к пептиду сопряжено с его синтезом, при котором происходит частичное сворачивание белка. Гликозилирование происходит путем ферментативных модификаций глика-на-субстрата и следующего за этим процессинга, в ходе которого происходит ветвление, удлинение и сиалирование гликанов.
N-гликозилирование начинается с перемещения заранее сформированного олигосахарида GIc3-Man9-GlcNAc2 от липида-носителя на остаток аспарагина синтезирующегося полипептида. Затем основной олигосахарид укорачивается путем последовательного отделения глюкоз-ных остатков при участии а-глюкозидазы I и а-глюкозидазы II с образованием "высокоманнозно-го" гликана Man9-GlcNAc2 [23]. Локализованный в аппарате Гольджи фермент маннозидаза I удаляет четыре остатка маннозы, образуя Man5GlcNAc2, а к оставшимся остаткам маннозы добавляется N-ацетилглюкозамин. В результате образуется цепочка GlcNAcMan5GlcNAc2. Далее комплекс гликанов преобразуется при участии ферментов NAcGlc-трансферазы I, маннозидазы II, NAcGlc-трансферазы II и NAcGlc-трансферазы IV. Затем фукозилтрансфераза, галактозилтрансфераза и сиалилтрансфераза завершают модификацию, присоединяя к гликопротеину фукозу, три остатка галактозы (Gal) и три остатка сиаловой кислоты (SA) соответственно. В процессе ферментативных модификаций гликана гликопротеин входит в кальнексин-кальретикулиновый цикл, на протяжении которого лектины ЭР специфически взаимодействуют с гликопротеином, обеспечивая его сворачивание. Если это сворачивание невер-
но, а-глюкозидаза дегликозилирует белок, который повторно взаимодействует с кальнекси-ном/кальретикулином [24]. Этот цикл продолжается до тех пор, пока белок не примет нативную форму. Нарушение действия а-глюкозидаз ведет к образованию тригликозилированных гликанов, усиливающих взаимодействие гликопротеина с кальретикулином и, как следствие, к образованию агрегатов неверно свернутых гликопротеи-нов. Это приводит к образованию дефектных вирусных частиц, нарушает секрецию вируса из клетки и подавляет способность вируса
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.