ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2013, том 451, № 6, с. 691-694
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.15
ВЛИЯНИЕ ПРОЛОНГИРОВАННОГО СТРЕПТОЗОТОЦИНОВОГО ДИАБЕТА НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У КРЫС © 2013 г. К. В. Деркач, И. В. Мойсеюк, А. О. Шпаков
Представлено академиком Н.П. Веселкиным 20.12.2012 г. Поступило 09.01.2013 г.
БО1: 10.7868/80869565213250233
Сахарный диабет 1-го типа (СД1) и заболевания щитовидной железы (ЩЖ) являются наиболее распространенными эндокринопатиями, между которыми, как показали исследования последних лет, имеются тесные взаимосвязи. Еще в 1980 г. было установлено, что у пациентов с СД1 повышен риск заболеваний аутоиммунным тиреоиди-том (АИТ) [1]. В дальнейшем появились данные о более высокой встречаемости АИТ, а также субклинических гипо- и гипертиреоидных состояний у больных СД1 в сравнении с пациентами, не страдающими СД, что послужило основанием для выделения сочетанного развития СД1 и АИТ в отдельный тип полиэндокринопатий [2, 3].
Для своевременной диагностики и эффективного лечения таких полиэндокринопатий необходимо понимание патогенетических механизмов, лежащих в основе их развития, для чего требуются адекватные модели СД1 на животных, близкие к этому заболеванию у человека. Обычно используемые краткосрочные модели СД1, которые вызываются одноразовой инъекцией высокой дозы (65—80 мг/кг) стрептозотоцина (СТЦ), характеризуются абсолютным дефицитом инсулина, острой гипергликемией и сильной интоксикацией организма. В результате в гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной (ГГТ-) оси возникают значительные нарушения [4], что приводит к резкому снижению уровня тиреоидных гормонов и выраженному гипотиреозу у диабетических животных и не отражает реальную ситуацию с дисфункциями ЩЖ при СД1 человека [5]. Необходимо отметить, что в течение первых трех дней после постановки диагноза СД1 у детей с выраженными гипергликемией и кетоацидозом также сильно снижаются уровни свободного и общего
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург
T4, общего T3 и индекс свободного тироксина [6]. В дальнейшем при лечении инсулином и адекватном гликемическом контроле эти показатели частично восстанавливаются. Это указывает на то, что для изучения нарушений функций ЩЖ при СД1 необходимы его мягкие модели, которые развиваются на протяжении длительного времени и характеризуются относительной инсулино-вой недостаточностью и умеренно выраженной гипергликемией, что сближает их с СД1 человека.
Цели работы состояли в изучении функционального состояния ГГТ-оси у крыс с разработанной нами моделью пролонгированного СД1, который вызывали последовательными инъекциями СТЦ в субмаксимальных дозах, а также в оценке влияния длительной терапии интрана-зальным инсулином (ИИ) на функции ЩЖ. В задачи исследования входили: изучение базового и стимулированного тиролиберином содержания тиреотропного гормона (ТТГ) и тиреоидных гормонов у крыс с пролонгированным СД1 в динамике развития заболевания, сравнительное изучение чувствительности аденилатциклазы (АЦ) к действию ТТГ в тироидальных мембранах диабетических и здоровых животных, оценка влияния длительной обработки животных ИИ на эти показатели.
СД1 вызывали тремя последовательными ин-траперитонеальными инъекциями СТЦ, растворенного в 0.1 М цитратном буфере (pH 4.5), пятимесячным крысам-самцам популяции Wistar. Инъекции СТЦ в дозе 40, 35 и 30 мг/кг проводили в 1-е, 10-е и 80-е сут эксперимента. На 9-е сут после каждой инъекции в крови животных, взятой из хвостовой вены, измеряли уровень глюкозы с помощью тест-полосок ("One Touch Ultra", США) и глюкометра ("Life Scan Johnson & Johnson", Дания), а затем отбирали для дальнейших экспериментов тех крыс, уровень глюкозы у которых был выше 11 мМ. Концентрацию инсулина в сыворотке крови животных измеряли с ис-
692
ДЕРКАЧ и др.
Таблица 1. Содержание тиреоидных гормонов и ТТГ в крови крыс с пролонгированным СД1 продолжительностью 150 и 210 сут в сравнении с контрольными животными, а также влияние длительного лечения интраназаль-ным инсулином на уровень гормонов
Группа крыс
Общий Т4, нМ Свободный Т4, пМ Общий Т3, нМ
ТТГ, мкЕд/мл
К, n = 8 КИ, n = 7 Д, n = 8 ДИ, n = 7
К, n = 8 КИ, n = 7 Д, n = 8 ДИ, n = 7
150 сут после первой инъекции стрептозотоцина
52.9 ± 1.4 52.5 ± 1.9 46.9 ± 2.2*1 48.3 ± 2.5
59.9 ± 3.6 53.3 ± 3.0 39.9 ± 2.7*2 46.1 ± 3.2
16.6 ± 0.5 15.2 ± 0.4*3 10.8 ± 0.6*2 13.0 ± 0.5*2, *3
1.36 ± 0.06
1.37 ± 0.07 1.14 ± 0.05*1 1.23 ± 0.04
210 сут после первой инъекции стрептозотоцина
18.6 ± 0.7 16.9 ± 0.7 14.0 ± 0.4*2 16.3 ± 0.8*3
1.39 ± 0.06 1.16 ± 0.06*3 1.05 ± 0.05*2 1.10 ± 0.08
ND ND ND ND
0.31 ± 0.06 0.69 ± 0.14*3 0.68 ± 0.10*1 1.11 ± 0.22
*1, *2 _ различия между значениями концентраций гормонов у крыс групп К и Д или групп КИ и ДИ достоверны при Р < 0.05 и Р < 0.005;*3 — различия между значениями концентраций гормонов у крыс групп К и Ки или групп Д и ДИ достоверны при Р < 0.05.
пользованием наборов Rat Insulin ELISA ("Merco-dia AB", Швеция).
На 75-е сут эксперимента диабетические крысы были разделены на две группы: одна (ДИ) получала лечение ИИ, другая (Д) — цитратным буфером без инсулина. Соответствующим образом на две группы были разделены и контрольные животные (К и КИ). Интраназальное введение инсулина проводили, как описано ранее [7]. Кристаллический инсулин в концентрации 24 МЕ/мл растворяли в 0.1 М цитратном буфере (pH 4.5) и вводили интраназально крысам из групп ДИ и КИ 1 раз в день в объеме 20 мкл, что составило 0.48 МЕ гормона на животное. Лечение ИИ проводили в течение 135 сут. Через 24 ч после последнего введения гормона животных декапитирова-ли, удаляли у них ткани ЩЖ и замораживали их в жидком азоте. Кровь для определения содержания гормонов забирали дважды — через 150 и 210 (при забое) сут после первой инъекции СТЦ. Тест с интраназальным тиролиберином в дозе 100 мкг/кг проводили на 190-е сут после первой инъекции СТЦ. Тиролиберин растворяли в 20 мкл физиологического раствора, вводили интраназально и через 2 ч забирали кровь для определения концентрации в ней тиреотропного гормона (ТТГ) и тиреоидных гормонов трииодтиронина (Т3) и тироксина (Т4). Для установления уровня ТТГ использовали набор Rat Thyroid Stimulating Hormone (TSH) Elisa Kit ("Cusabio Biotech Co.", Бельгия), для определения уровня свободного T4, общего Т4 и общего Т3 — наборы Тироид ИФА-свободный Т4, Тироид ИФА-тироксин-01 и Тироид ИФА-трииодтиронин-01 ("Алкор-Био", Россия).
Изучали животных четырех групп: 1) группа К, п = 8, масса 412 ± 18 г, уровень глюкозы 4.9 ± 0.3 мМ, уровень инсулина 2.2 ± 0.2 нг/мл (все показатели здесь и далее — в конце эксперимента); 2) группа КИ, п = 7, 428 ± 22 г, 4.9 ± 0.2 мМ, 1.5 ± 0.2 нг/мл; 3) группа Д, п = 8, 354 ± 24 г, 16.7 ± 3.0 мМ, 0.3 ± ± 0.1 нг/мл; 4) группа ДИ, п = 7, 379 ± 19 г, 11.0 ± ± 2.4 мМ, 0.4 ± 0.2 нг/мл.
Выделение фракций частично очищенных плазматических мембран из ЩЖ крыс и установление в них активности АЦ осуществляли, как описано ранее [8, 9]. Ферментативную реакцию проводили в течение 12 мин при 37°С, активность АЦ выражали в пикомолях цАМФ/мин на 1 мг мембранного белка. Для определения активности АЦ использовали [а-32Р]-АТФ (4 Ки/ммоль), который получали из ОАО "Реакторные материалы" (Россия).
Статистический анализ полученных данных проводили с использованием программы ANOVA. Данные представлены в виде М± Б.Е.М. из трех независимых экспериментов. Различия между пробами оценивали как достоверные при Р < 0.05.
В крови крыс с 210-суточным СД1 концентрация ТТГ была достоверно выше, чем в контроле. Содержание общего и свободного Т4 и общего Т3 у диабетических крыс как со 150-суточным, так и с 210-суточным СД было достоверно снижено в сравнении с контрольной группой животных (табл. 1). Снижение уровня тиреоидных гормонов при повышенной концентрации ТТГ указывает на развитие гипотиреоидного состояния, обусловленного гипофункцией ЩЖ в условиях пролонгированного СД1. Лечение диабетических крыс ИИ, которое начинали через 75 сут после первой инъекции СТЦ, приводило к частичному или полно-
ВЛИЯНИЕ ПРОЛОНГИРОВАННОГО СТРЕПТОЗОТОЦИНОВОГО ДИАБЕТА
693
д100 о 80
о
я
ю
о «
Я
св &
я
о Я
я
о
а
60
40
20
К 1 1 КИ Д 1 1 ДИ
40 -
4 Т
о
о
§30
о ю о
я тп о 20
10 -
(г)
I : 1 —\2
Г]
К
КИ
Д
ДИ
Рис. 1. Влияние обработки контрольных и диабетических крыс интраназальным тиролиберином на содержание у них общего Т4 (а), свободного Т4 (б), общего Т3 (в) и ТТГ (г).
1 и 2 — концентрация гормонов у крыс одной группы соответственно до и после обработки тиролиберином; *, ** — достоверность различий при Р < 0.05 и Р < 0.005 соответственно (в каждой группе п = 5).
0
0
4
3
2
1
0
му восстановлению сниженного в условиях СД уровня тиреоидных гормонов. Только при 150-су-точном СД содержание свободного Т4 оставалось более низким в сравнении с таковым в группе КИ. Обработка ИИ также приводила к значительному повышению концентрации ТТГ, уровень которого при СД и так был повышен. Следует отметить, что ИИ вызывал достоверное повышение концентрации ТТГ и у контрольных крыс, что, однако, существенно не влияло на содержание у них общего и свободного Т4, но было сопряжено со снижением уровня общего Т3 (табл. 1).
Введение интраназального тиролиберина (100 мкг/кг), который использовали для оценки функциональной активности ГГТ-оси, приводило к значительному повышению уровня тиреоидных гормонов и ТТГ во всех исследованных группах крыс (рис. 1). При этом повышение уровня общего и свободного Т4 у обработанных тироли-берином диабетических крыс было менее выраженным по сравнению с таковым контрольных животных. Так, прирост концентрации общего и свободного Т4 при СД составил 57 и 44% от такового в контроле. Прирост концентрации общего Т3 в группах К и Д существенно не различался.
Длительное лечение ИИ усиливало стимулирующее влияние тиролиберина на секрецию ТТГ в обеих группах животных — ДИ и КИ, причем у диабетических крыс прирост концентрации гормона был на 75% выше, чем в контроле. Вызванные тиролиберином приросты
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.