БИОХИМИЯ, 2011, том 76, вып. 9, с. 1238 - 1247
УДК 577.056
ВЛИЯНИЕ ПРОТЕАСОМНОГО ИНГИБИТОРА БОРТЕЗОМИБА НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ И АКТИВНОСТЬ КИНАЗЫ Akt*
© 2011 г. Л.А. Панищева**, Е.С. Какпакова, Е.Ю. Рыбалкина, А.А. Ставровская**
НИИ канцерогенеза Учреждения РАМН Онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, 115478 Москва, Каширское ш., 24; электронная почта: panlidia@gmail.com, astavrovskaya@yahoo.com
Поступила в редакцию 15.03.11 После доработки 10.04.11
Исследованы механизмы регуляции транспортных белков семейства АВС противоопухолевым препаратом нового поколения протеасомным ингибитором бортезомибом (Velcade). АВС-Транспортеры определяют множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток. Подтверждены ранее полученные нами данные, показывающие, что бортезомиб влияет на экспрессию генов, участвующих в формировании МЛУ (гены АВСВ1 или MDR1 и АВСС1 или MRP1), снижая количество их мРНК. Обнаружено, что этот эффект зависит от активности киназы Akt: ингибитор активности Akt Ly 294002 повышал количество мРНК гена MRP1 в клетках KB 8—5. Показано также, что бортезомиб увеличивает количество фосфорилирован-ной формы Akt-киназы в клетках линий КВ 8—5 и К 562/Í-S9, которые гиперэкспрессируют транспортер АВСВ1 (Pgp), и не влияет на количество активированной Akt в соответствующих клетках дикого типа. При воздействии бортезомиба отбор резистентных к нему клеток происходит гораздо быстрее из клеточной популяции, гиперэкспрессирующей Pgp (по сравнению с клетками дикого типа). Показано, что бортезомиб влияет на количество мРНК гена MRP1, перемещая при этом многофункциональный белок YB-1, зависимый от активности Akt , из цитоплазмы в ядро клеток рака молочной железы MCF-7. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что одним из механизмов, определяющих влияние бортезомиба на количество мРНК гена MRP1, может быть транскрипционная активность YB-1.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: семейство белков АВС, множественная лекарственная устойчивость опухолей, бортезомиб, Akt-киназа.
Цель данной работы — исследование механизмов регуляции транспортных белков семейства АВС при воздействиях на популяции опухолевых клеток протеасомного ингибитора бортезомиба, в частности определение роли сигнального пути PI3K/Akt и белка YB-1 в этом процессе. Противоопухолевый препарат нового поколения бортезомиб (Velcade) — первый и наиболее известный, используемый в онкологической клинике селективный протеасомный ингибитор
Принятые сокращения: МЛУ — множественная лекарственная устойчивость, Pgp — Р-гликопротеин, АТ — антитела, ХМЛ — хронический миелолейкоз, PI3K — фос-фоинозитол-3-киназа, п.н. — пара нуклеотидов, СКО — стволовые клетки опухоли.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 11-095 , 17.07.2011.
** Адресат для корреспонденции.
[1]. Он применяется для лечения множественных миелом, лимфом и некоторых других опухолей. Бортезомиб — водорастворимое соединение, дипептидил бороновой кислоты, которая ковалентно связывается с активным остатком Thrl на ^-конце каталитической субъединицы Р5 20S коровой части протеасомы и ингибирует ее химотрипсиноподобную активность. Бортезомиб, основная функция которого — ингибирова-ние протеасом, способен, как нами было показано ранее, влиять на количество мРНК некоторых генов семейства АВС и кодируемых ими белков. Последние могут определять множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток [2]. Опубликованные данные свидетельствуют о том, что бортезомиб влияет на активность ряда ключевых сигнальных каскадов и сигнальных молекул клетки, в том числе и на сигнальный путь PI3K/Akt [3, 4].
Каскад PI3K/Akt — это путь передачи сигнала, связанный с фосфатидилинозитол-3-кина-зой (PI3K). PI3K осуществляет фосфорилирова-ние фосфатидилинозита (PI), фосфатидилино-зит-4-монофосфата (PI4P) и фосфатидилино-зит-4,5-дифосфата (PI-4,5-P2) до PI-3-P , PI-3,4-P2 и PI-3,4,5-P3 соответственно [5, 6]. Сигнальный путь PI3K/Akt регулирует процессы клеточного роста, пролиферации, ангиогенеза и внутриклеточного метаболизма. Активация сигнального пути PI3K/Akt в опухолевых клетках после стресса может регулировать устойчивость опухолевых клеток к действию химиотерапевти-ческих препаратов, а также степень чувствительности злокачественных опухолей к радиотерапии [7]. Одним из основных звеньев сигнального пути PI3K/Akt является серин/треонино-вая киназа Akt (также известная как PKB). С момента своего открытия в качестве протоонкоге-на киназа Akt привлекает внимание многих исследователей в связи со своей важной регуля-торной ролью в различных процессах, в том числе в прогрессии опухолей и в метаболизме инсулина.
Ранее в нашей лаборатории было обнаружено, что существует связь между активностью сигнального пути PI3K/Akt и развитием МЛУ. Мы показали, что сигнальный путь PI3K/Akt и его компонент mTOR вносят вклад в развитие многофакторной МЛУ опухолевых клеток при воздействии цитостатиков как за счет прямого влияния на выживаемость клеток, так и за счет влияния на активность транспортных белков семейства АВС [8, 9].
В семейство АВС (ATP Binding Cassette) входит >100 белков различных организмов — от бактерий до человека [10]. Большинство этих белков транспортирует в клетках разнообразные вещества (от ионов до полипептидных цепей). Часть этих белков определяет лекарственную устойчивость клеток. При исследовании опухолей, устойчивых к терапии, чаще всего обнаруживают повышенную экспрессию одного из следующих АВС-транспортеров: ABCB1 (Р-гли-копротеин - Pgp), ABCC1 (MRP1) и ABCG2 (BCRP) [11, 12]. Обнаруживают и повышенную экспрессию одновременно нескольких АВС-транспортеров при МЛУ. В работе [2] мы показали, что бортезомиб влияет на экспрессию мРНК некоторых генов семейства АВС и их белков, которые могут определять МЛУ опухолевых клеток.
Активность белка YB-1 связана как с МЛУ, так и с сигнальным путем PI3K/Akt. Он является членом семейства ДНК- и РНК-связываю-щих белков с эволюционно-консервативным доменом холодового шока. YB-1 принимает
участие во многих ДНК- и мРНК-зависимых процессах [13, 14]. Этот белок обнаруживается как в ядре, так и в цитоплазме клеток млекопитающих. Функционируя в качестве фактора транскрипции в ядре, YB-1 регулирует в клетке экспрессию генов, содержащих Y-боксы в промоторах, в том числе генов МЛУ MDR1 и LRP [13, 14]. В цитоплазме YB-1 — один из основных белков, связывающихся с мРНК и формирующих мРНП (рибонуклеопротеиновые частицы) с уникальными физико-химическими характеристиками. От его количества в мРНП зависит скорость синтеза различных белков. Таким образом, с локализацией YB-1 в клетках связаны разные молекулярные механизмы, определяющие его влияние на фенотип опухолевых клеток. Известно, что гиперэкспрессия YB-1 наблюдается в опухолях разного гистогенеза [15]. Найдено, что активность YB-1 стимулируется киназой Akt [16, 17].
Задача данной работы — выяснить, связано ли влияние бортезомиба на экспрессию генов и белков МЛУ с его воздействием на сигнальный путь PI3K/Akt и на белок YB-1. Мы попытались также понять, с какими особенностями клеточного контекста могут быть связаны различия в изучаемой нами реакции клеток на бортезомиб. Мы обнаружили, что бортезомиб активирует киназу Akt в условиях гиперэкспрессии Pgp, что продолжительное воздействие бортезомиба приводит к отбору клеток с конститутивно-активированной Akt в первую очередь в популяции малигнизированных клеток с гиперэкспрессией Pgp. Влияние бортезомиба на МЛУ малигнизированных клеток может быть связано с перемещением под его влиянием белка YB-1 из цитоплазмы в клеточные ядра.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Реагенты. Были использованы: бортезомиб (Velcade; BEN VENUE Laboratories, Inc., США); поликлональные кроличьи антитела против белкаУВ-1, предоставленные лабораторией Л.П. Овчинникова (Институт белка РАН); монокло-нальные антитела против актина (MAB1501R) и тубулина («Chemicon», США); флуоресцентно-меченные вторые антитела к иммуноглобулинам кролика (Alexa Fluor 488 (green), «Invitrogen», США); вторые антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой (АР160Р, «Chemicon»); поликлональные кроличьи антитела против фосфорилированной АКТ1 (Ser473) (АВ3132, «Chemicon»), вторые антитела к иммуноглобулинам кролика, конъюгированные с пе-роксидазой (АР132Р, «Chemicon»); антитела
против Pgp, напрямую меченные фикоэритри-ном (CD243-PE, «Beckman Coulter», США), мо-ноклональные антитела CD38-PE и CD34-PE («Beckman Coulter»).
Линии клеток. Линию клеток хронического миелолейкоза человека К 562 [18] и ее сублинию, гиперэкспрессирующую Pgр (K 562/i-S9) [19], поддерживали на среде RPMI 1640 с 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Также использовали клетки эпидермоид-ной карциномы полости рта человека КВ 3—1 и клетки сублинии КВ 8—5, гиперэкспрессирую-щие Pgр, отобранные на резистентность к колхицину [20], клетки MCF-7 — линия клеток аде-нокарциномы молочной железы человека [21]. Клетки выращивали на среде DMEM с 10% сыворотки. Все клетки культивировали при 37° в атмосфере 5% CO2.
МТТ-Тест. Детали метода были описаны ранее [8]. Проводили не менее трех независимых экспериментов.
Выделение РНК и ОТ-ПЦР. Процедура была описана ранее [22]. Суммарную РНК выделяли с помощью TRI Reagent («Sigma», США) в соответствии с протоколом производителя. Реакцию обратной транскрипции (ОТ) проводили с использованием гексамерных праймеров. Для выравнивания количества кДНК в разных образцах амплифицировали ген домашнего хозяйства GAPDH. Для амплификации продуктов нужной длины использовали следующие специфические праймеры: GAPDH, 513 пар нуклеотидов (п.н.) (CCCCTGGCCAAGGTCATCCATGACAACTTT (прямой), GGCCATGAGGTCCACCACCCTGT-TGCTGTA (обратный)); MDR1, 167 п.н. (CCC-ATCATTGCAATAGCAGG (прямой), GTTCAA-ACTTCTGCTCCT GA (обратный)); MRP1, 180 п.н. (ATCAAGACCGCTGTCATTGG (прямой), GAG-CAAGGATGACTTGCAGG (обратный); YB1, 476 п.н. (ACAAGAAGGTCATCGCAACGAAG (прямой), GGTTGGAATACTGTGGTCGACG (обратный). Условия амплификации: 30 с при 94°, после чего 25
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.