ЖУРНАЛ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ, 2007, том 57, № 2, с. 181-190
ФИЗИОЛОГИЯ ПОВЕДЕНИЯ; ^^^^^^^^^^^^ ОБУЧЕНИЕ И ПАМЯТЬ
УДК 612.821.6
ВЛИЯНИЕ ПРОЦЕДУРЫ ИМИРИНТИНГА НА КЛЕТОЧНУЮ ПРОЛИФЕРАЦИЮ В МОЗГЕ ЦЫПЛЕНКА
© 2007 г. Н. В. Комиссарова, К. В. Анохин
Лаборатория нейробиологии памяти Научно-исследовательского института нормальной физиологии
им. П.К.Анохина РАМН, Москва,
e-mail: natallko@yahoo.com Поступила в редакцию 02.11.2006 г. Принята в печать 25.12.2006 г.
В работе исследовано влияние процедуры импринтинга на клеточную пролиферацию в структурах мозга новорожденного цыпленка, претерпевающих пластические изменения при импринтин-ге. Пролиферирующие клетки выявляли иммуногистохимически на срезах мозга по включению в ДНК 5-бромодезоксиуридина (BrdU), который вводили перед обучением; число новых клеток подсчитывали через 24 ч и через 7 сут после обучения в промежуточном медиальном мезопалли-уме, промежуточном аркопаллиуме, медиальной части мезопаллиума и нидопаллиума, дорзока-удальном нидопаллиуме, гиппокампе и парагиппокампальной области. Через 24 ч после обучения в промежуточном медиальном мезопаллиуме наблюдалось увеличение числа BrdU-положи-тельных клеток. Однако через 7 дней после обучения число содержащих BrdU клеток снижалось в медиальном нидопаллиуме и мезопаллиуме, в дорзокаудальном нидопаллиуме и правом промежуточном медиальном мезопаллиуме. Таким образом, процедура импринтинга оказывала разнонаправленные краткосрочные и долгосрочные влияния на генез новых клеток в мозге цыпленка, вызывая появление большего числа клеток в паренхиме мозга через 1 сут после обучения и уменьшая их численность через длительные сроки. Такой двойной эффект может быть связан с тем, что процедура импринтинга инициирует в мозге одновременно два процесса, вовлекающих регуляцию клеточной пролиферации, - созревание видоспецифической функциональной системы следования за особями своего вида и запоминание характеристик конкретного родителя.
Ключевые слова: импринтинг, обучение, клеточная пролиферация, BrdU.
Effect of Filial Imprinting Procedure on Cell Proliferation in the Chick Brain
N. V. Komissarova, K. V. Anokhin
Laboratory for Neurobiology of Memory, P.K. Anokhin Institute of Normal Physiology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, e-mail: natallko@yahoo.com
In the present study we tested the hypothesis that memory formation during visual imprinting might be related to generation of new cells in the brain of newborn domestic chicks. Cell proliferation was examined in the intermediate medial mesopallium (IMM), arcopallium intermedium (AI), medial part of ni-dopallium and mesopallium (MNM), nidopallium dorso-caudalis (Ndc), hippocampus (Hp) and area para-hippocampalis (APH), as well as in corresponding ventricular zones. Number of new cells was measured by BrdU incorporation 24 h or 7 days after training, BrdU was injected before training. 24 h after imprinting the number of BrdU-positive cells increased significantly in IMM. 7 days after training no changes were observed in IMM, while the number of new cells decreased in MNM and Ndc in comparison to the control group. These data suggest that newly generated cells in the brain of young chicks are influenced by imprinting procedure, which has opposite short-term and long-term effects. A possible reason for such double action of imprinting in contrast to conventional learning can be its additional stimulation of development of predisposition for features of natural parents.
Key words: imprinting, cell proliferation, learning, BrdU.
Клеточная пролиферация и нейрогенез в мозге млекопитающих в настоящее время активно исследуются: показано, что эти процессы подвержены влиянию множества внешних факторов, в том числе обучения, и могут быть критически необходимыми для формирования памяти в определенных моделях [23, 24]. Однако сравнительно мало внимания уделяется связи нейрогенеза и процессов обучения у других позвоночных, в том числе у птиц. Обширный и интенсивный нейрогенез у птиц позволяет предположить, что в нервной системе этого класса животных могут существовать иные механизмы пластичности, чем у млекопитающих, связанные с вовлечением и специализацией новых нейронов [2, 4, 13].
Особый интерес представляет нейрогенез и его взаимосвязь с формированием реакции следования за матерью у новорожденных цыплят. Импринтинг - это особый вид обучения, сочетающий в себе врожденное поведение и приобретение индивидуального опыта [8, 17]. Импринтинг почти необратим и возможен только в течение первых 1-3 сут после вылуп-ления [8]. Известно, что в первые дни жизни продукция новых клеток в мозге цыплят идет очень активно [12]. В случае, если клеточная пролиферация действительно каким-то образом вовлекается в процесс формирования памяти при импринтинге, можно ожидать, что запе-чатление импринт-объекта отразится на количестве новообразованных клеток в структурах мозга, отражая их участие в формировании предпочтения.
Целью настоящего исследования было проверить эту возможность, исследуя влияние процедуры импринтинга на клеточную пролиферацию в мозге новорожденного цыпленка с помощью введения животным маркера пролиферации 5-бромодезоксиуридина (ВМЩ
МЕТОДИКА
Работа выполнена на цыплятах обоих полов породы Ломон Браун. Протоколы экспериментов были утверждены биоэтическим комитетом НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН. Куриные эмбрионы доставляли с птицефабрики в возрасте 1315 дней и содержали в свето- и звукоизолирующем инкубаторе при температуре 37.5°С вплоть до вылупления. Затем цыплят помещали в специально оборудованные термостаты, где они содержались в течение 1-х суток после вылупления в темноте при температуре 33°С.
В суточном возрасте всем цыплятам внут-рибрюшинно вводили раствор BrdU в дозе 100 мг/кг. Через 30 мин после инъекции цыплят контрольных групп высаживали в домашние пеналы размером 20 х 20 х 25 см, в которых они далее содержались парами с неограниченным доступом к воде и корму. Цыплят двух экспериментальных групп через 30 мин после введения BrdU импринтировали в течение 1 ч, затем также высаживали в домашние боксы. Через 24 ч после инъекции цыплят одной контрольной группы и одной экспериментальной группы декапитировали и извлекали мозг. Цыплят двух оставшихся групп декапитировали через 7 сут после инъекции BrdU.
В работе была использована модель им-принтинга, предложенная Б. МакКейбом с со-авт. [21]. Импринтирование проводили во вращающемся колесе на освещенное вращающееся чучело курицы в течение 60 мин в темном помещении при 28 ± 1°С. Для повышения общей активности цыплят во время процедуры им проигрывали запись материнского зова курицы. Ранее было показано, что такая процедура импринтинга приводит к выраженному предпочтению импринт-объекта [20]. Нами был также проведен дополнительный эксперимент с целью проверки того, что инъекция 100 мг/кг 5-бромодезоксиуридина не препятствует формированию памяти при импринтин-ге. Для этого использовали две дополнительные группы цыплят: одну контрольную (n = = 17), которой вводили 100 мг/кг BrdU и через 30 мин высаживали в домашние боксы, и одну экспериментальную (n = 13), которую импринтировали в течение 1 ч через 30 мин после инъекции 100 мг/кг BrdU. Животных обеих групп тестировали на предпочтение импринт-объекта (чучела курицы) через 3 ч и через 24 ч после обучения.
Цыплят тестировали путем одновременного предъявления объекта, на который проводился импринтинг (чучела курицы), и нового объекта (красного куба) в течение 10 мин. Уровень предпочтения определялся величиной коэффициента предпочтения, который рассчитывали как отношение числа оборотов колеса в сторону чучела курицы к общему числу оборотов.
Для проведения иммуногистохимической реакции на BrdU цыплят декапитировали, извлекали мозг и замораживали его в парах жидкого азота. Иммуногистохимическую реакцию проводили в планшетах (Thermo Shandon, Coverplate) на криостатных срезах толщиной
20 мкм. Предварительно срезы фиксировали в 4%-ном параформальдегиде и выдерживали в растворе 2Н HCl для денатурации ДНК. Для иммуногистохимической реакции использовали моноклональные антитела к BrdU (mouse anti-BrdU, Chemicon, разведение 1:200, инкубация в течение 12-18 ч), затем срезы промывали и инкубировали со вторичными антителами (horse anti-mouse IgG, Vector, Elite ABC Kit, разведение 1:200) в течение 2 ч, после чего срезы промывали и вносили на пластины раствор АВ-комплекса (авидин+биотин 1:1, Elite ABC Kit, anti-mouse IgG, Vector, разведение 1:100) и инкубировали в течение 1 ч. После инкубации срезы промывали, извлекали из пеналов и окрашивали раствором диаминобензидина. Затем стекла проводили через последовательность спиртов с возрастающими концентрациями и заключали под покровные стекла.
Подсчет BrdU-позитивных клеток в структурах мозга проводили в программме для анализа изображений AnalySIS 2.5, статистическую обработку данных осуществляли в программе Sta-tistica 6.0 с помощью критерия Манна - Уитни для сравнения экспериментальных групп и критерия Вилкоксона для анализа межполушар-ной асимметрии. Плотность BrdU-меченых клеток в каждой структуре рассчитывали как отношение числа BrdU-позитивных клеток к площади, занимаемой этой структурой на срезе. Локализацию структур, содержащих BrdU-положительные клетки, определяли по параллельным срезам, окрашенным по Нис-слю с использованием стереотаксического атласа мозга цыпленка (Куэнзель В.Дж., Мэйсон M., 1988). Необходимые структуры выделяли вручную в программе AnalySIS.
Количественный анализ плотности BrdU-меченых клеток проводили в структурах, критически необходимых для зрительного имприн-тинга - промежуточном медиальном мезопал-лиуме (IMM) и промежуточном аркопаллиуме (AI), в областях, необходимых для аудиторного импринтинга - дорзокаудальном нидопаллиуме (Ndc) и медиальной части мезопаллиума и нидо-паллиума (MNM), а также в других аcсоциатив-ных областях - гиппокаме (Hp) и парагиппо-кампальной области (APH). Область IMM -один из высших ассоциативных центров у птиц, является критически необходимым для зрительного имприн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.