ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ. Серия Б, 2015, том 57, № 5, с. 334-337
МЕДИЦИНСКИЕ ПОЛИМЕРЫ
УДК 541.64:546.56
ВЛИЯНИЕ РАЗМЕРОВ ПОР ПОЛИАКРИЛАМИДНОГО ГИДРОГЕЛЯ НА АКТИВНОСТЬ ИММОБИЛИЗОВАННОГО БЕЛКА1
© 2015 г. Л. И. Валуев, И. Л. Валуев, Л. В. Ванчугова, И. В. Обыденнова
Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева Российской академии наук
119991 Москва, Ленинский пр., 29
Поступила в редакцию 17.03.2015 г. Принята в печать 03.06.2015 г.
Исследована зависимость активности иммобилизованного в полиакриламидном гидрогеле трипсина от способа получения гидрогеля, степени его набухания и размеров пор. Показано, что измеряемая активность трипсина, иммобилизованного на стадии формирования гидрогеля, всегда выше, чем активность трипсина, иммобилизованного реакцией с активированным гидрогелем. Активность иммобилизованного трипсина тем выше, чем больше степень набухания гидрогеля и чем меньше количество пор большого размера. Определяющим фактором в проявлении активности являются размеры пор.
DOI: 10.7868/S2308113915050174
Интерес к полимерным гидрогелям с иммобилизованными белками обусловлен в первую очередь их уникальными возможностями для решения ряда прикладных задач по созданию высокоактивных каталитических систем и аффинных сорбентов, в том числе биосовместимых гемосор-бентов для избирательного извлечения из крови токсичных соединений. В работах, посвященных решению подобных задач (а количество таких работ в последние годы возрастает лавинообразно — см., например, работы [1—5]), сами гидрогели обычно рассматриваются как инертные носители, основная функция которых заключается в переводе белка в нерастворимое состояние. При этом роль структуры гидрогеля в проявлении иммобилизованным соединением присущей ему активности практически не обсуждается. Принимая во внимание, что в живых организмах большинство биологически активных соединений функционирует в связанном с гидрогелевыми мембранами клеток состоянии, да и сами биологические мембраны содержат в своем составе связанные белки, во многом определяющие активный транспорт через мембраны [6], гидрогели на основе синтетических полимеров можно рассматривать как модели природных мембран. Кроме того, выяснение роли структуры гидрогеля в проявлении активности иммобилизованным в нем
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 15-08-02105) и Федерального агентства научных организаций (тема 48, государственная регистрация № 012013530).
E-mail: valuev@ips.ac.ru (Валуев Лев Иванович).
соединением может способствовать пониманию особенностей функционирования биологических мембран. В работе [7] при изучении гидрогелей, полученных путем сополимеризации ненасыщенного производного белкового ингибитора протеолитических ферментов (так называемого макромономера) с гидрофильным мономером и сшивающим агентом, было обнаружено, что сорбционная способность (активность) иммобилизованного белка в значительной степени определяется структурой гидрогеля. Она тем выше, чем меньше содержание в гидрогеле пор большого размера. В какой степени эта закономерность применима к белкам, осуществляющим не только сорбцию субстрата, но и его дальнейшую трансформацию, и относится к системам, полученным иммобилизацией белка в объеме уже сформированного гидрогеля, и как структура гидрогелей влияет на кинетику взаимодействия белка с соответствующим субстратом, оставалось не ясным.
Цель настоящей работы — исследование активности белка, иммобилизованного в полиакри-ламидном гидрогеле по двум принципиально различным методикам: связывание с готовым гидрогелем и связывание с гидрогелем на стадии его образования, а также изучение влияния способа иммобилизации и размеров пор гидрогеля на кинетику взаимодействия иммобилизованного белка с физиологическим субстратом. Носителем служил полиакриламидный гидрогель, белком — протеолитический фермент трипсин, его субстратом — низкомолекулярный М-а-бензоил-Э,Ь-ар-гинин-п-нитроанилид и высокомолекулярный
ВЛИЯНИЕ РАЗМЕРОВ ПОР ПОЛИАКРИЛАМИДНОГО ГИДРОГЕЛЯ
335
овомукоид — ингибитор трипсина из белка утиных яиц.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали акриламид, NjN'-мети-ленбисакриламид, персульфат аммония и ^^№,№-тетраметилэтилендиамин (ТМЭД), хлорангидрид акриловой кислоты, N-a-бензоил-Э,Ь-аргинин-п-нитроанилид (БАПА), меркапто-уксусную кислоту фирмы "Serva" (Германия), инсулин (М = 6.5 х 103), апротинин (М = 6.5 х 103), трипсин (М = 24 х 104), бычий сывороточный альбумин (М = 6.7 х 104), лактат дегидрогеназа (М = 1.4 х 105) фирмы "Sigma" (США). Акрило-ил-N-гидроксифталимидом (АГФИ) синтезировали по методике [8]. Овомукоид выделяли из белка утиных яиц по методике [9].
Гидрогели синтезировали по шести различным методикам. Гидрогель А-1 получали смешением раствора 100 мг АГФИ и 0.25 мл ТМЭД в 5 мл этанола с раствором 4.0 г акриламида, 0.08 г N,N'-метиленбисакриламида и 0.05 г персульфата аммония в 50 мл бидистиллированной воды и выдерживанием смеси при комнатной температуре в течение 2—3 ч. Образующийся гидрогель промывали водой. Гидрогель А-2 получали по аналогичной методике, но в присутствии 0.05 г меркап-тоуксусной кислоты. Криогель А-3 синтезировали по методике [10] замораживанием водного раствора мономеров и инициаторов при температуре — 10°C и выдерживанием смеси при этой температуре в течение 24 ч.
Для иммобилизации трипсина 10 г синтезированных гидрогелей инкубировали с 50 мл раствора с концентрацией трипсина 2.0 мг/мл в 0.5 М трис-HCl буфере (pH 8.0), содержащем 0.1 М NaCl и 0.02 М CaCl2, в течение 5 ч. Концентрацию иммобилизованного трипсина оценивали по количеству не вошедшего в реакцию фермента.
Гидрогель Б-1 получали добавлением к 50 мл раствора макромономера трипсина 4.0 г акриламида, 0.08 г ^№-метиленбисакриламида, 0.05 г персульфата аммония и 0.25 мл ТМЭД и выдерживанием смеси при комнатной температуре в течение 2—3 ч. Образующийся гидрогель промывали водой. Макромономер трипсина получали добавлением при 0°С 0.3 мл хлорангидрида акриловой кислоты к 50 мл раствора трипсина (3.5 мг/мл) в бикарбонатном буфере (рН 8.0) при перемешивании в течение 60 мин [11]. Гидрогель Б-2 типа получали по аналогичной методике, но в присутствии 0.05 г меркаптоуксусной кислоты. Криогель Б-3 синтезировали по методике [10] замораживанием водного раствора макромономера трипсина, акриламида, ^№-метиленбисакрила-мида и инициаторов при температуре — 10°C и
выдерживанием смеси при этой температуре в течение 24 ч.
Степень набухания гидрогелей оценивали гравиметрически и рассчитывали по формуле 8г = = тх/т2 — 1, где т1 и т2 — масса равновесно набухшего и лиофильно высушенного гидрогеля соответственно.
Для изучения проницаемости гидрогелей набухший в воде гель измельчали с помощью механического пресса через сито с диаметром пор 1 мм. К 2 мл геля добавляли 4 мл раствора белка. Смесь оставляли при 4°С до установления постоянного значения оптической плотности раствора белка, измеряемой на спектрофотометре "Нка-еЫ-3410" (Япония) при 280 нм (обычно не более 48 ч). Концентрацию белка в исходном растворе и в растворе после инкубирования с гелем определяли с помощью построенной для каждого белка калибровочной зависимости. Учитывая соотношение объемов фаз, рассчитывали количество пор, доступных для каждого белка, принимая за 100% количество пор, доступных для воды.
Активность трипсина оценивали по скорости гидролиза низкомолекулярного субстрата БАПА [12] или по способности трипсина образовывать комплексы с белковым ингибитором, в качестве которого использовали овомукоид — гликопроте-ин с М = 3.1 х 104.
Для определения емкости гидрогелей по ово-мукоиду 5 г геля инкубировали с 10 мл раствора 40 мг овомукоида в 0.05 М трис-НС\ буфере, рН 8.0, содержащем 0.5 М №С1, при перемешивании до установления постоянной оптической плотности раствора ингибитора при 280 нм (обычно не более 2 ч). Связавшийся ингибитор элюировали 0.2 М КС1, рН 2.0. Концентрацию выделившегося ингибитора определяли спектро-фотометрически.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для изучения зависимости активности иммобилизованного трипсина от структуры полимерного носителя использовали два принципиально различных подхода к формированию гидрогелей с иммобилизованным белком. Первый подход (А) заключался в синтезе активированного гидрогеля путем сополимеризации акриламида с М,№-ме-тиленбисакриламидом и АГФИ и последующем взаимодействии активированного гидрогеля с трипсином по схеме
336
ВАЛУЕВ и др.
Гидрогель—СН—СН2—ъ Трипсин—МН2 —Гидрогель—СН—СН2—
СО
I
0
1
ж
ОС СО
со
I
МН-трипсин
Второй подход (Б) включал иммобилизацию трипсина на стадии формировании гидрогеля. Для этого трипсин сначала ацилировали хлоран-гидридом акриловой кислоты
Трипсин- МН2 + СН2=СНСОС1 — — Трипсин-МН-СО-СН=СН2 Затем образующийся макромономер сополи-меризовали с акриламидом и М,М-метиленбиса-криламидом. Регулирование структуры гидрогелей достигали либо проведением реакции сопо-лимеризации в присутствии передатчика цепи — меркаптоуксусной кислоты, либо полимеризацией раствора мономеров в замерзшем состоянии. Оценку доступности активных центров иммобилизованного трипсина проводили путем измерения его гидролитической активности по отношению к низкомолекулярному субстрату и связывающей способности по отношению к высокомолекулярному субстрату. Поскольку нет оснований предполагать, что сама иммобилизация изменяет элементарный акт взаимодействия активных центров трипсина с соответствующими субстратами, измеряемая гидролитическая активность иммобилизованного трипсина по отношению к низкомолекулярному субстрату и его связывающая способность по отношению к высокомолекулярному субстрату могут служить мерой доступности активных центров по отношению к этим субстратам. Свойства синтезированных гидрогелей приведены в табл. 1.
Видно, что, во-первых, физическая структура гидрогелей и механизм ее формирования действительно являются факторами, в значительной степени определяющими измеряемую активность иммобилизованного трипсина. Скорее всего, это обусловлено исключением части активных центров молекул ф
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.