научная статья по теме ВЛИЯНИЕ РАЗМЕРОВ ПОР ПОЛИАКРИЛАМИДНОГО ГИДРОГЕЛЯ НА АКТИВНОСТЬ ИММОБИЛИЗОВАННОГО БЕЛКА Химия

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ РАЗМЕРОВ ПОР ПОЛИАКРИЛАМИДНОГО ГИДРОГЕЛЯ НА АКТИВНОСТЬ ИММОБИЛИЗОВАННОГО БЕЛКА»

ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ. Серия Б, 2015, том 57, № 5, с. 334-337

МЕДИЦИНСКИЕ ПОЛИМЕРЫ

УДК 541.64:546.56

ВЛИЯНИЕ РАЗМЕРОВ ПОР ПОЛИАКРИЛАМИДНОГО ГИДРОГЕЛЯ НА АКТИВНОСТЬ ИММОБИЛИЗОВАННОГО БЕЛКА1

© 2015 г. Л. И. Валуев, И. Л. Валуев, Л. В. Ванчугова, И. В. Обыденнова

Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева Российской академии наук

119991 Москва, Ленинский пр., 29

Поступила в редакцию 17.03.2015 г. Принята в печать 03.06.2015 г.

Исследована зависимость активности иммобилизованного в полиакриламидном гидрогеле трипсина от способа получения гидрогеля, степени его набухания и размеров пор. Показано, что измеряемая активность трипсина, иммобилизованного на стадии формирования гидрогеля, всегда выше, чем активность трипсина, иммобилизованного реакцией с активированным гидрогелем. Активность иммобилизованного трипсина тем выше, чем больше степень набухания гидрогеля и чем меньше количество пор большого размера. Определяющим фактором в проявлении активности являются размеры пор.

DOI: 10.7868/S2308113915050174

Интерес к полимерным гидрогелям с иммобилизованными белками обусловлен в первую очередь их уникальными возможностями для решения ряда прикладных задач по созданию высокоактивных каталитических систем и аффинных сорбентов, в том числе биосовместимых гемосор-бентов для избирательного извлечения из крови токсичных соединений. В работах, посвященных решению подобных задач (а количество таких работ в последние годы возрастает лавинообразно — см., например, работы [1—5]), сами гидрогели обычно рассматриваются как инертные носители, основная функция которых заключается в переводе белка в нерастворимое состояние. При этом роль структуры гидрогеля в проявлении иммобилизованным соединением присущей ему активности практически не обсуждается. Принимая во внимание, что в живых организмах большинство биологически активных соединений функционирует в связанном с гидрогелевыми мембранами клеток состоянии, да и сами биологические мембраны содержат в своем составе связанные белки, во многом определяющие активный транспорт через мембраны [6], гидрогели на основе синтетических полимеров можно рассматривать как модели природных мембран. Кроме того, выяснение роли структуры гидрогеля в проявлении активности иммобилизованным в нем

1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 15-08-02105) и Федерального агентства научных организаций (тема 48, государственная регистрация № 012013530).

E-mail: valuev@ips.ac.ru (Валуев Лев Иванович).

соединением может способствовать пониманию особенностей функционирования биологических мембран. В работе [7] при изучении гидрогелей, полученных путем сополимеризации ненасыщенного производного белкового ингибитора протеолитических ферментов (так называемого макромономера) с гидрофильным мономером и сшивающим агентом, было обнаружено, что сорбционная способность (активность) иммобилизованного белка в значительной степени определяется структурой гидрогеля. Она тем выше, чем меньше содержание в гидрогеле пор большого размера. В какой степени эта закономерность применима к белкам, осуществляющим не только сорбцию субстрата, но и его дальнейшую трансформацию, и относится к системам, полученным иммобилизацией белка в объеме уже сформированного гидрогеля, и как структура гидрогелей влияет на кинетику взаимодействия белка с соответствующим субстратом, оставалось не ясным.

Цель настоящей работы — исследование активности белка, иммобилизованного в полиакри-ламидном гидрогеле по двум принципиально различным методикам: связывание с готовым гидрогелем и связывание с гидрогелем на стадии его образования, а также изучение влияния способа иммобилизации и размеров пор гидрогеля на кинетику взаимодействия иммобилизованного белка с физиологическим субстратом. Носителем служил полиакриламидный гидрогель, белком — протеолитический фермент трипсин, его субстратом — низкомолекулярный М-а-бензоил-Э,Ь-ар-гинин-п-нитроанилид и высокомолекулярный

ВЛИЯНИЕ РАЗМЕРОВ ПОР ПОЛИАКРИЛАМИДНОГО ГИДРОГЕЛЯ

335

овомукоид — ингибитор трипсина из белка утиных яиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали акриламид, NjN'-мети-ленбисакриламид, персульфат аммония и ^^№,№-тетраметилэтилендиамин (ТМЭД), хлорангидрид акриловой кислоты, N-a-бензоил-Э,Ь-аргинин-п-нитроанилид (БАПА), меркапто-уксусную кислоту фирмы "Serva" (Германия), инсулин (М = 6.5 х 103), апротинин (М = 6.5 х 103), трипсин (М = 24 х 104), бычий сывороточный альбумин (М = 6.7 х 104), лактат дегидрогеназа (М = 1.4 х 105) фирмы "Sigma" (США). Акрило-ил-N-гидроксифталимидом (АГФИ) синтезировали по методике [8]. Овомукоид выделяли из белка утиных яиц по методике [9].

Гидрогели синтезировали по шести различным методикам. Гидрогель А-1 получали смешением раствора 100 мг АГФИ и 0.25 мл ТМЭД в 5 мл этанола с раствором 4.0 г акриламида, 0.08 г N,N'-метиленбисакриламида и 0.05 г персульфата аммония в 50 мл бидистиллированной воды и выдерживанием смеси при комнатной температуре в течение 2—3 ч. Образующийся гидрогель промывали водой. Гидрогель А-2 получали по аналогичной методике, но в присутствии 0.05 г меркап-тоуксусной кислоты. Криогель А-3 синтезировали по методике [10] замораживанием водного раствора мономеров и инициаторов при температуре — 10°C и выдерживанием смеси при этой температуре в течение 24 ч.

Для иммобилизации трипсина 10 г синтезированных гидрогелей инкубировали с 50 мл раствора с концентрацией трипсина 2.0 мг/мл в 0.5 М трис-HCl буфере (pH 8.0), содержащем 0.1 М NaCl и 0.02 М CaCl2, в течение 5 ч. Концентрацию иммобилизованного трипсина оценивали по количеству не вошедшего в реакцию фермента.

Гидрогель Б-1 получали добавлением к 50 мл раствора макромономера трипсина 4.0 г акриламида, 0.08 г ^№-метиленбисакриламида, 0.05 г персульфата аммония и 0.25 мл ТМЭД и выдерживанием смеси при комнатной температуре в течение 2—3 ч. Образующийся гидрогель промывали водой. Макромономер трипсина получали добавлением при 0°С 0.3 мл хлорангидрида акриловой кислоты к 50 мл раствора трипсина (3.5 мг/мл) в бикарбонатном буфере (рН 8.0) при перемешивании в течение 60 мин [11]. Гидрогель Б-2 типа получали по аналогичной методике, но в присутствии 0.05 г меркаптоуксусной кислоты. Криогель Б-3 синтезировали по методике [10] замораживанием водного раствора макромономера трипсина, акриламида, ^№-метиленбисакрила-мида и инициаторов при температуре — 10°C и

выдерживанием смеси при этой температуре в течение 24 ч.

Степень набухания гидрогелей оценивали гравиметрически и рассчитывали по формуле 8г = = тх/т2 — 1, где т1 и т2 — масса равновесно набухшего и лиофильно высушенного гидрогеля соответственно.

Для изучения проницаемости гидрогелей набухший в воде гель измельчали с помощью механического пресса через сито с диаметром пор 1 мм. К 2 мл геля добавляли 4 мл раствора белка. Смесь оставляли при 4°С до установления постоянного значения оптической плотности раствора белка, измеряемой на спектрофотометре "Нка-еЫ-3410" (Япония) при 280 нм (обычно не более 48 ч). Концентрацию белка в исходном растворе и в растворе после инкубирования с гелем определяли с помощью построенной для каждого белка калибровочной зависимости. Учитывая соотношение объемов фаз, рассчитывали количество пор, доступных для каждого белка, принимая за 100% количество пор, доступных для воды.

Активность трипсина оценивали по скорости гидролиза низкомолекулярного субстрата БАПА [12] или по способности трипсина образовывать комплексы с белковым ингибитором, в качестве которого использовали овомукоид — гликопроте-ин с М = 3.1 х 104.

Для определения емкости гидрогелей по ово-мукоиду 5 г геля инкубировали с 10 мл раствора 40 мг овомукоида в 0.05 М трис-НС\ буфере, рН 8.0, содержащем 0.5 М №С1, при перемешивании до установления постоянной оптической плотности раствора ингибитора при 280 нм (обычно не более 2 ч). Связавшийся ингибитор элюировали 0.2 М КС1, рН 2.0. Концентрацию выделившегося ингибитора определяли спектро-фотометрически.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для изучения зависимости активности иммобилизованного трипсина от структуры полимерного носителя использовали два принципиально различных подхода к формированию гидрогелей с иммобилизованным белком. Первый подход (А) заключался в синтезе активированного гидрогеля путем сополимеризации акриламида с М,№-ме-тиленбисакриламидом и АГФИ и последующем взаимодействии активированного гидрогеля с трипсином по схеме

336

ВАЛУЕВ и др.

Гидрогель—СН—СН2—ъ Трипсин—МН2 —Гидрогель—СН—СН2—

СО

I

0

1

ж

ОС СО

со

I

МН-трипсин

Второй подход (Б) включал иммобилизацию трипсина на стадии формировании гидрогеля. Для этого трипсин сначала ацилировали хлоран-гидридом акриловой кислоты

Трипсин- МН2 + СН2=СНСОС1 — — Трипсин-МН-СО-СН=СН2 Затем образующийся макромономер сополи-меризовали с акриламидом и М,М-метиленбиса-криламидом. Регулирование структуры гидрогелей достигали либо проведением реакции сопо-лимеризации в присутствии передатчика цепи — меркаптоуксусной кислоты, либо полимеризацией раствора мономеров в замерзшем состоянии. Оценку доступности активных центров иммобилизованного трипсина проводили путем измерения его гидролитической активности по отношению к низкомолекулярному субстрату и связывающей способности по отношению к высокомолекулярному субстрату. Поскольку нет оснований предполагать, что сама иммобилизация изменяет элементарный акт взаимодействия активных центров трипсина с соответствующими субстратами, измеряемая гидролитическая активность иммобилизованного трипсина по отношению к низкомолекулярному субстрату и его связывающая способность по отношению к высокомолекулярному субстрату могут служить мерой доступности активных центров по отношению к этим субстратам. Свойства синтезированных гидрогелей приведены в табл. 1.

Видно, что, во-первых, физическая структура гидрогелей и механизм ее формирования действительно являются факторами, в значительной степени определяющими измеряемую активность иммобилизованного трипсина. Скорее всего, это обусловлено исключением части активных центров молекул ф

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»