научная статья по теме ВЛИЯНИЕ РЕАГЕНТОВ, УВЕЛИЧИВАЮЩИХ ВЯЗКОСТЬ СРЕДЫ, НА СИНТЕЗ АТФ В ТИЛАКОИДАХ ХЛОРОПЛАСТА Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ РЕАГЕНТОВ, УВЕЛИЧИВАЮЩИХ ВЯЗКОСТЬ СРЕДЫ, НА СИНТЕЗ АТФ В ТИЛАКОИДАХ ХЛОРОПЛАСТА»

БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 3, с. 481-486

= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =

УДК 576.311.342.6

ВЛИЯНИЕ РЕАГЕНТОВ, УВЕЛИЧИВАЮЩИХ ВЯЗКО СТЬ CP ЕДЫ, НА СИНТЕЗ АТФ В ТИЛАКОИДАХ ХЛОРОПЛАСТА

© 2015 г. И.М. Карташов, В.К. Опанасенко, А.Н. Мальян

Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290, Пущино Московской области, Институтская ул., 2

E-mail: opanasenko45@mail.ru Поступила в p едакцию 21.10.14 г.

И сследовано влияние увеличения вязкости реакционной среды на циклическое фотофосфори-лирование в тилакоидах хлоропластов и на Са2+-зависимый гидролиз АТФ сопрягающим фактором CFi. Показано, что добавление в реакционную среду агентов разной природы (сахарозы, декстрана 40, полиэтиленгликоля 6000), увеличивающих вязкость ср еды, приводит к уменьшению скорости синтеза АТФ при концентрации АДФ 0,1-0,2 мМ в условиях, когда эти агенты еще не вызывают ни разобщения, ни ингибирования переноса электронов в отсутствие АДФ. Декстран и полиэтиленгликоль ингибировали синтез АТФ на 50% при концентрациях гораздо меньших (6-10%), чем сахароза (30-40%), тогда как 50%-е ингибирование Са2+-зависимого гидролиза АТФ CFl-ATФазой наблюдалось при более высоких концентрациях декстрана и полиэтиленгликоля (9-13%), но при более низких концентрациях сахарозы (около 20%). Установлено, что эффективная константа Михаэлиса (Км) для АДФ с возрастанием вязкости среды увеличивается в два-три раза, при этом максимальная скорость циклического фотофосфорилирования остается постоянной. Сделан вывод о том, что зависимость Км от вязкости среды может служить критерием функционирования процесса фотофосфорилирования в диффузионно-контролируемом режиме. Обсуждаются возможные механизмы диффузии АДФ и АТФ.

Ключевые слова: хлоропласты, фотофосфорилирование, электронный транспорт, гидролиз АТФ, сопрягающий фактор хлоропластов CF1, вязкость.

Вязкость - одна из фундаментальных характеристик жидкости как внутри живой клетки, так и в реакционной среде. При исследовании процессов клеточного метаболизма in vitro обычно учитывают влияние на скорости реакций температуры, рН, ионной силы и осмотического давления реакционной среды, но не вязкости, хотя известно, что изменение вязкости среды оказывает влияние на все ферментативные реакции, исследованные до настоящего времени [1,2]. Вязкость клеточной цитоплазмы обусловлена в основном сахарами и макромолекулами - белками и полисахаридами, которые в р астворе набухают, связывая молекулы воды. П ри этом отдельные части макро -молекул приобретают некоторую подвижность и способность образовывать межмолекулярные водор одные связи, что может приводить к образованию гелеобразных структур. Считается, что содержание в цитоплазме эндогенных агентов, повышающих вязкость, находится в пределах 50-400 мг/мл и повышается в условиях стресса так, что их молекулы могут занимать до 40% объема клетки, свободного от ор ганелл [1,3]. Очевидно, что повышение вязкости ср еды

должно затруднять диффузию субстратов и про -дуктов ферментативных реакций, что можно зарегистрировать экспериментально как ингибирование скорости работы конкретного фермента реагентами, увеличивающими вязкость реакционной среды. С другой стороны, повышение вязкости может действовать по механизму внутримолекулярного трения, т.е. непосредственно на сам фермент, замедляя конформа-ционные переходы в его активном центре [4].

В настоящей работе впервые экспериментально исследовано влияние увеличения вязкости реакционной ср еды, создаваемого р азлич-ными реагентами - полиэтиленгликолем, дек-страном и сахарозой - на фотофосфорилиро-вание АДФ АТФ-синтазой тилакоидных мембран и предпринята попытка выявить возможный механизм этого влияния. Для этого мы определяли скорость синтеза АТФ пр и вар ьи-ровании концентрации АДФ и агентов, повышающих вязкость (сахарозы, декстрана 40 и полиэтиленгликоля 6000), а для выяснения влияния этих агентов на каталитическую часть АТФ-синтазы (сопрягающий фактор хлор опла-стов СР 1) исследовали кинетику С а 2+-зависи-

О 10 20 30

Концентрация реагентов, вес.%

Рис. 1. Влияние реагентов, повышающих вязкость, на скорость циклического фотофосфорилирования (V/Vmax, %), катализируемого феназинметасульфа-том при концентрации АДФ 0,2 мМ: 1 - сахароза, 2 - декстран, 3 - полиэтиленгликоль. Скорость реакции в контроле равнялась 250 мкмоль на 1 мг хлорофилла в час. Условия см. в «Материалах и методах».

мого гидролиза АТФ при насыщающей концентрации субстрата реакции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Тилакоиды хлоропластов выделяли из двухнедельных листьев гороха по методике, описанной ранее [5]. Полученные тилакоиды пр о -мывали при темпер атуре 4°С в растворе, со -державшем 0,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 0,2 М сахарозы, 10 мМ трицин-KOH (рН 7,8), 10 мМ NaCl и 5 мМ MgCl2, затем ресуспендировали и хранили в той же среде при концентр ации хлор офилла 2-3 мг/мл. Концентрацию хлор офилла определяли по методу Ар нона [6].

В экспер иментах использовали реакционные среды без альбумина, термостатированные при 25°С и содержавшие вышеуказанные концентрации солей, 100 мМ сахарозы, хлоропласты (40 мкг Хл/мл), акцептор электр онов - 0,05 мМ феназинметасульфата или 0,5 мМ феррициани-да и различные концентр ации буферов. П ри измерении транспорта электронов для оценки фотосинтетического контр оля мембран использовали среду, содержавшую 5 мМ HEPES + 5 мМ тр ицина (р Н 7,8) ± грамицидин Д, а при измерении синтеза АТФ - различные концентрации АДФ, 2 мМ Pj, и 2 мМ трицина (рН 7,8). Тилакоиды не имели каталазной активности, поэтому в серийных экспериментах мы не использовали ингибиторы каталазы. Для реги-

страции кинетики реакций хлоропласты освещали белым светом (200 Вт/м2) в течение 0,5-2,0 мин.

Тр анспорт электронов и синтез АТФ регистрировали с помощью рН -электрода по заще-лачиванию реакционной ср еды. Количество поглощенных протонов определяли титрованием ср еды известными количествами HCl. Скоро сть синтеза АТФ рассчитывали по известной методике [7]. Разброс данных для всех измерений на препаратах одного выделения не превышал 5%.

С опр ягающий фактор хлор опластов CFj выделяли по методу Биндера с соавт. [8] и хранили в 2 М (NH4)2SO4 в присутствии 1 мМ АТФ. После обессоливания фермента гель-фильтрацией через колонку с сефадексом G-50 проводили тиол-зависимую активацию CFj в ср еде, содержащей 50 мМ трис-HCl fcH 7,81), 50 мМ KCl, 0,1 мМ ЭДТА и 50 мМ дитиотреитола, в течение двух часов при комнатной температуре. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда [9]. Об активности препарата судили по скорости выделения неорганического фосфата [10] в реакционной среде, содер жащей 50 мМ трис-HCl ^H 7,8), 50 мМ KCl, 0,1 мМ ЭДТА, 6 мМ CaCl2, 5 мМ АТФ и CFj, пр и температуре 25°С [11].

Вязко сть, создаваемую реагентами, оценивали по литературным данным [12-14].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Измерение скор о сти синтеза АТФ в тила-коидах в различных условиях показало, что при концентрации АДФ 0,2 мМ, близкой к насыщению этой реакции в отсутствие агентов, повышающих вязкость, все исследованные реа -генты ингибируют скорость циклического фотофосфорилирования. Влияние реагентов, увеличивающих вязкость реакционной ср еды, на скорость циклического фотофосфорилирования (У/Утах, %), катализируемого феназинметасуль-фатом при концентрации АДФ 0,2 мМ, показано на рис. 1. Сахароза оказалась наименее эффективным ингибитором - для достижения 50%-го ингибирования ее требовалось в три-четыре раза больше, чем полиэтиленгликоля или декстрана.

Чтобы выяснить, влияют ли реагенты, повышающие вязкость, на сопрягающий фактор CFj, исследовали их действие на гидролиз АТФ изолированным ферментом. Как видно на рис. 2, исследованные реагенты ингибировали гидролиз АТФ, причем 50%-е ингибирование декстраном и полиэтиленгликолем, в отличие от синтеза АТФ (рис. 1), наблюдалось в диа-

Рис. 2. Зависимости скорости Са2+-активируемого гидролиза АТФ СБ^АТФазой от концентрации в реакционной среде агентов, повышающих вязкость: 1 - сахароза, 2 - декстран, 3 - полиэтиленгликоль. Единице активности соответствует АТФазная активность СБ!, равная 0,82 мкмоль/мин на мг фермента. Условия см. в «Материалах и методах».

пазоне 9-13 вес.%, что несколько выше, чем диапазон ингибирования синтеза АТФ (7-10%). С другой стороны, та же степень ингибир ования гидролиза АТФ сахарозой достигалась при значительно меньшей ее концентрации (около 20%), чем в случае фотофосфорилирования.

Для оценки влияния агентов, повышающих вязкость, на тилакоидные мембраны (возможность диссипации протонного градиента или ингибирования комплексов цепи электр онного транспорта) была использована реакция переноса электронов от воды к феррицианиду в отсутствие АДФ. Лимитир ующей стадией этой реакции является депротонирование пластогид-рохинона на люменальной стороне цитохром-ного комплекса, так как закисление люмена тормозит перенос электронов между фотосистемами. Агенты, повышающие вязкость, практически не проникают в люмен, и если они не индуцируют трансмембранной утечки Н+ и не ингибируют комплексы цепи, то не должны влиять и на скор ости пер еноса электр онов. Поэтому для оценки их влияния можно использовать фотосинтетический контроль - отношение или разность скоростей базального переноса электронов от воды к феррицианиду в отсутствие и в пр исутствии 2 мкМ гр амицидина Д, котор ый является эффективным разобщителем, обеспечивающим максимальную скорость электронного транспорта [15]. Снижение фотосинтетического контр оля свидетельствует о ра -зобщении (если увеличивается скор ость базаль-ного транспорта) или об ингибировании пере-

Рис. 3. Действие сахарозы на перенос электронов от воды к феррицианиду в отсутствие (1) и в присутствии (2) 2 мкМ грамицидина Д. Данные приведены в виде отношения скоростей базального перено са к скорости разобщенного грамицидином Д в отсутствие сахарозы. Пунктиром показано действие сахарозы на скорость синтеза АТФ (У/Утах) при концентрациях аДф 0,2 мМ (3) и 0,1 мМ (4).

носа (если снижается скорость разобщенного транспорта электронов).

Эксперименты по оценке влияния агентов, повышающих вязкость, на фотосинтетический контроль показали, что 30

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»