ш
УДК 577.29
ВЛИЯНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА НУКЛЕОФОЗМИНА-1 НА ПРОНИКНОВЕНИЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ РНК В КЛЕТКИ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ЧЕЛОВЕКА MCF-7
© 2014 г. А. В. Савельева*, **, #, Д. В. Семенов*, Г. А. Степанов*, Д. Н. Барякин*, Е. В. Кулигина*, И. В. Рабинов*, О. А. Коваль*, **, В. А. Рихтер*
*Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 8
**Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, 630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 2 Поступила в редакцию 13.03.2013 г. Принята к печати 14.08.2013 г.
Получен и охарактеризован рекомбинантный аналог (Npm1-His6) нуклеофозмина-1 человека, многофункционального ядрышкового фосфопротеина NPM1, участвующего в ключевых процессах жизнедеятельности клеток, таких, как транскрипция, репарация и митоз. Проведен анализ взаимодействия полученного Npm1-His6 с синтетическими некодирующими РНК in vitro и его влияния на эффективность накопления внеклеточных нуклеиновых кислот в клетках аденокарциномы молочной железы MCF-7. Установлено, что рекомбинантный белок Npm1-His6 увеличивает эффективность трансфекции РНК, обладающей развитой вторичной структурой, в клетки человека. Полученные данные позволяют заключить, что нуклеофозмин-1 не только связывает РНК c развитой вторичной структурой, но и способствует захвату и интернализации таких РНК клетками человека.
Ключевые слова: нуклеофозмин-1, синтетические аналоги РНК, А1и-РНК, С/Б-бокс-РНК, трансфек-ция РНК в клетки человека, клетки аденокарциномы ЫС¥-7.
DOI: 10.7868/S0132342314010096
ВВЕДЕНИЕ
Многофункциональный ядрышковый фосфо-протеин нуклеофозмин-1 (NPM1) участвует в ключевых процессах жизнедеятельности клеток, таких как транскрипция, репарация и митоз. Недавно было показано, что нуклеофозмин-1 присутствует во внеклеточном пространстве, а его взаимодействие с синтетическим аналогом miR-122 повышает устойчивость микроРНК к действию РНКазы А in vitro.
Сокращения: HPRT — ген, кодирующий гипоксантин-гуа-нин-фосфорибозилтрансферазу; IMDM — среда Дульбекко в модификации Исков; MCF-7 — клеточная линия аденокарциномы молочной железы человека; miR — микро-РНК; NPM1 — нуклеофозмин-1; Npm1-Hisg — рекомбинантный аналог нуклеофозмина-1 человека; ВПЧ — вирусоподобные частицы киллерного штама К2 дрожжей S. cerevisiae Y448; МТТ — 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромид; мяоРНК — малые яд-рышковые РНК; НК — нуклеиновые кислоты; ОТ-ПЦР — обратная траскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией.
#Автор для связи (тел.: +7 (383) 363-51-89; эл. почта: save-lyevaav@niboch.nsc.ru).
Ген ЫРЫ1 кодирует три изоформы белка, образующиеся за счет альтернативного сплайсинга пре-мРНК [1]. Полноразмерная форма белка нуклеофозмин-1 (изоформа В23.1) имеет сложное мультидоменное строение (рис. 1). Отличительной характеристикой белков семейства нук-леофозминов/нуклеоплазминов является наличие домена олигомеризации на ^-конце. В норме нуклеофозмин-1 образует декамер, в котором два пентамера, состыкованные голова к голове, образуют двухкамерную бочкообразную структуру [3]. Каждый мономер нуклеофозмина содержит три домена, обогащенные остатками аспарагиновой и глутаминовой кислот: А1, А2 и А3. А1-Домен в центральной части МРМ1 отвечает за взаимодействие с гистонами Н3 и Н4, домены А2 и А3 участвуют во взаимодействии с коровыми гистонами Н2А и Н2В [4]. Область между доменами А2 и А3 содержит сигнал ядерной локализации [5]. С-Кон-цевой участок МРМ1 содержит кластер, обогащенный основными и ароматическими аминокислотными остатками. Этот домен отвечает за связывание нуклеиновых кислот [6—8] и АТР [9], а также за транспорт гистонов [4] и локализацию белка в
Домен
Met олигомеризации A1 NES A2 NLS A3
Домен, связывающий нуклеиновые кислоты
NPM1
NoLS
Рис. 1. Строение нуклеофозмина-1 человека (в соответствии с работой [2]). A1—A3 — домены, обогащенные остатками аспарагиновой и глутаминовой кислот; NES — сигнал экспорта из ядра (nuclear export signal); NLS — сигнал локализации в ядре (nuclear localization signal); NoLS — сигнал ядрышковой локализации (nucleolar localization signal); Met — регион, богатый остатками метионина.
ядрышке [10]. Рибонуклеазная активность позволяет нуклеофозмину-1 осуществлять процессинг рибосомных РНК [11]; при этом активный центр, обладающий рибонуклеазной активностью, формируется с участием аминокислот, расположенных между доменами A1 и A2 [12]. Благодаря наличию сигналов ядерной и ядрышковой локализации, а также сигнала экспорта из ядра, нуклеофозмин участвует в процессах ядерно-цитоплазматическо-го транспорта белков [13]. Кроме того, нуклеофоз-мин-1 играет важную роль в процессах репарации ДНК, транскрипции и митоза [4, 14—16].
В силу своей полифункциональности NPM1 является одновременно опухолевым супрессором и протоонкогеном. Мутации в этом гене часто встречаются при остром миелоидном лейкозе [17], раке щитовидной железы [18] и астроцитомах [19].
Недавно Ванг с соавт. показали, что нуклео-фозмин-1 присутствует в неэкзосомной фракции культуральной среды клеток первичной культуры фибробластов легкого и клеток гепатокарциномы HepG2, культивированных в условиях сывороточного голодания [20]. Авторами также было показано, что miR-122 в комплексе с NPM1 проявляла повышенную устойчивость к гидролизу РНКазой А in vitro [20]. Эти данные позволили предположить, что белок нуклеофозмин-1 является компонентом внеклеточных циркулирующих рибонуклеопроте-иновых комплексов и непосредственно участвует в упаковке и экспорте микро-РНК клетками млекопитающих. При этом нерешенным оставался вопрос об участии нуклеофозмина-1 в процессах захвата и интернализации внеклеточных РНК клетками-реципиентами. В настоящей работе было проведено иссследование влияния рекомбинант-ного нуклеофозмина-1 на эффективность транс-фекции синтетических аналогов некодирующих РНК в клетки человека.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Создание штамма-продуцентарекомбинантного белка нуклеофозмина-1
Ген NPM1 (Chr 5 q35) кодирует три изоформы нуклеофозмина: B23.1 (NP_002511), B23.2 (NP_954654) и B23.3 (NP_001032827). В данной работе был получен рекомбинантный аналог изо-
формы B23.1, экспрессируемой большинством клеток органов и тканей человека [2]. Изоформа B23.1 состоит из 294 а.о., формирующих полный набор доменов NPM1 (рис. 1). Фрагмент ДНК, кодирующий изоформу B23.1, получали методом ОТ-ПЦР с суммарной РНК клеток аденокарци-номы молочной железы человека MCF-7 в качестве матрицы. Для подбора праймеров использовали последовательность NPM1 из базы данных GeneBank (NM_002520.6). В праймеры были введены участки узнавания рестриктазами EcoRI и BamHI, по которым полученный ген встраивали в линеаризованный вектор pET23a под контроль промотора Т7. Конструирование, анализ и отбор генетических конструкций проводили с помощью штамма E. coli Top10. Нуклеотидную последовательность вставки в плазмиду pET23a подтверждали методом секвенирования ДНК по Сэнгеру [21]. В качестве штамма-носителя для полученной экс-прессионной плазмиды pET23a_NPM1 использовали E. coli BL21 (DE3). В результате был создан продуцент E. coli BL21 (DE3)/pET23a_NPM1, при индукции которого нарабатывается рекомбинант-ный аналог нуклеофозмина-1, содержащий последовательность His6 на С-конце (Npm1-His6).
Наработка, выделение и очистка рекомбинантного аналога Npm1-His6
При подборе условий культивирования штаммов-продуцентов было установлено, что наибольшего выхода целевого белка (~18 мг с 1 литра культуры клеток E. coli) удается достичь с использованием метода автоиндукции [22].
При индукции биосинтеза рекомбинантного аналога Npm1-His6 в штаммах E. coli BL21 (DE3)/pET23a_NPM1 целевой белок нарабатывался преимущественно в растворимой форме. Очистку целевого белка Npm1-His6 из суперна-танта лизата клеток проводили ступенчатой ме-талл-хелатной хроматографией на Ni-NTA-сефа-розе. Npm1-His6 элюировали с сорбента, повышая концентрацию имидазола в буфере до 250 мМ (рис. 2а, фракция III). Электрофоретическая чистота полученных белковых препаратов Npm1-His6 составляла ~92%. Из данных рис. 2б видно, что препараты Npm1-His6 содержали один поли-
(а)
A
160 Объем, мл
кДа
116 -
66 -
45 -35 -
25 -
18.4 -14.4 -
-Npml-His6
кДа
116 -
66 -
45 -35 -
25 -
18.4 -14.4 -
-Npml-His6
мультимер
-Npml-His6
мономер
Рис. 2. Получение рекомбинантного аналога нуклеофозмина-1 человека. (а) Выделение рекомбинантного аналога Npml-Hisg аффинной хроматографией на Ni-NTA-сефарозе из лизата клеток продуцентов E. coli. Фракции белков: I — белки, не взаимодействующие с сорбентом; II и III — элюция буфером, содержащим 50 и 250 мМ имидазол. (б) Анализ белковых препаратов Npml-Hisg денатурирующим электрофорезом в 13% ПААГ. Дорожки: 1 — маркеры молекулярной массы белков; 2 — белки лизата клеток E. coliBL21 (DE3), трансформированных вектором pET23a_NPM1; 3 — препарат рекомбинантного Npm1-Hisg. Положение в геле рекомбинантного Npm1-Hisg показано стрелкой. (в) Анализ Npm1-Hisg денатурирующим электрофорезом в 13% ПААГ в отсутствие 2-меркаптоэтанола (2); положение в геле мономера и мультимера Npm1-Hisg показано стрелками; 1 — маркеры молекулярной массы белков; окрашивание Кумас-си G-250.
пептид с электрофоретической подвижностью, соответствующей белку с молекулярной массой ~40 ± ± 2 кДа. Структура полученного рекомбинантного аналога нуклеофозмина-1 — Npm1-His6 была подтверждена методом MALDI-TOF-масс-спектро-метрии продуктов его трипсинолиза.
Показано, что в невосстанавливающих условиях (в отсутствие ß-меркаптоэтанола) рекомбинантный аналог Npm1-His6 представлен мономерной и муль-тимерной формами (рис. 2в), при этом вклад муль-тимерной формы белка составлял ~66%.
Известно, что нуклеофозмин-1 присутствует в клетках человека в форме мономера и в форме де-камера, а олигомеризация происходит благодаря межмолекулярным взаимодействиям гидрофобных аминокислотных остатков ^-домена белка (рис. 1). Поэтому, формирование рекомбинант-ным аналогом мультимерных форм (рис. 2в) указывает на наличие у Npm1-His6 структурно-функциональных характеристик, сходных с нуклео-фозмином
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.