УДК597.5.591.132.05
ВЛИЯНИЕ рН НА АКТИВНОСТЬ ПРОТЕИНАЗ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ КИШЕЧНИКА, ХИМУСА И ЭНТЕРАЛЬНОЙ МИКРОБИОТЫ У РЫБ ИЗ КУЧУРГАНСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА © 2014 г. В. В. Кузьмина, Г. В. Золотарева*, В. А. Шептицкий*
Институт биологии внутренних вод РАН — ИБВВ, Борок Ярославской области *Приднестровский государственный университет — ПТУ, Тирасполь, Молдова E-mail: vkuzmina@ibiw.yaroslavl.ru Поступила в редакцию 07.03.2013 г.
В широком диапазоне значений рН исследована протеолитическая активность слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты у пяти видов рыб Кучурганского водохранилища (Молдова). Выявлены различия рН-зависимости активности протеиназ кишечника у видов рыб с разным типом питания. Максимальная активность протеиназ выявлена у солнечника Lepomis gibbo-sus, минимальная — у судака Zander lucioperca. У всех видов рыб оптимум рН протеиназ для слизистой оболочки и химуса (за исключением окуня Perca fluviatilis) соответствует 10. Оптимальные значения рН для кишечной микрофлоры зарегистрированы в диапазоне от 6 (карп Cyprinus carpio) до 10 (карась Carassius carassius); у окуня из Кучурганского и из Рыбинского водохранилищ этот оптимум установлен при рН 7. Для большинства видов рыб, особенно судака и солнечника, характерна высокая активность протеиназ микробиоты в диапазоне рН 6—9. Предполагается, что протеиназы эн-теральной микробиоты у рыб могут компенсировать относительно низкую активность протеиназ, синтезируемых их пищеварительной системой, в зоне низких значений рН.
Ключевые слова: рыбы, кишечник, протеиназы, слизистая оболочка, химус, энтеральная микробио-та, Кучурганское водохранилище.
DOI: 10.7868/S0042875214040067
Принято считать, что доминирующие в пище большинства видов рыб белки (Шатуновский, 1980; Кузьмина, 2005) деполимеризуются протеи-назами, синтезируемыми их пищеварительной системой (Barrington, 1957; Fange, Grove, 1979; Уголев, Кузьмина, 1993). Вместе с тем в настоящее время представления о процессах пищеварения претерпели значительное изменение. В частности, установлена важная роль ферментов объектов питания, реализующих индуцированный аутолиз, и микрофлоры кишечника, осуществляющей симбионтное пищеварение (Уголев, 1985), и обоснована их важная роль в процессах пищеварения у рыб (Кузьмина, 1996). Индуцированный аутолиз реализуется лизомальными гидролазами практически всех тканей рыб (Кузьмина, Цветкова, 2001; Кузьмина, 2005), симбионтное пищеварение — ферментами, синтезируемыми кишечной микрофлорой (Лубянскене и др., 1989; Шивокене, 1989; Кузьмина, Скворцова, 2002; Кузьмина, 2005). Показано, что ферменты объектов питания вносят значительный вклад в гидролиз пищевых субстратов в желудочно-кишечном тракте рыб (Кузьмина, 2000; Kuz'mina, Golovano-va, 2004). Важная роль энтеральной микробиоты в гидролизе различных компонентов пищи, в том
числе и специфических, также не вызывает сомнения (Лубянскене и др., 1989; Шивокене, 1989; Уголев, Кузьмина, 1993; Кузьмина, 2005; Кузьмина и др., 2012). Вклад ферментов микроорганизмов, обеспечивающих симбионтное пищеварение, корректно оценить невозможно, однако об их роли можно судить, используя сопоставление разных характеристик ферментов энтеральной микробиоты, а также ферментов, функционирующих в составе слизистой оболочки кишечника и химуса.
Наиболее подробно изучены характеристики гидролаз, локализованных на структурах слизистой оболочки кишечника рыб и обеспечивающих мембранное пищеварение (Уголев, Кузьмина, 1993; Кш'шта, Ое1шап, 1997; Кш'шта, 2008). При этом особое внимание уделялось изучению температурных характеристик ферментов, поскольку они в значительной мере отражают адаптации к температурным условиям среды обитания рыб (Уголев, Кузьмина, 1993; Ое1шап е! а1., 2008). У рыб из естественных водоёмов характеристики ферментов химуса, реализующих начальные этапы гидролиза белковых компонентов пищи в полости кишечника, исследованы в меньшей степени. При изучении влияния рН на ак-
тивность протеиназ у рыб из Рыбинского водохранилища были выявлены существенные видовые различия характеристик ферментов слизистой, химуса и энтеральной микробиоты (Кш'шта й а1., 2011). Поскольку в химусе помимо ферментов, синтезируемых поджелудочной железой рыб, присутствуют ферменты объектов их питания и кишечной микрофлоры (Кузьмина, 2005), можно предположить, что характеристики аналогичных ферментов у рыб из водоёмов с разным составом кормовой базы и микрофлоры могут отличаться. Вместе с тем сведения о влиянии особенностей среды обитания и спектра питания рыб на рН-функцию протеиназ, функционирующих в составе химуса и энтеральной микробиоты рыб, отсутствуют.
Цель работы — изучить влияние рН на протео-литическую активность слизистой оболочки кишечника, химуса и энтеральной микробиоты у рыб с разным типом питания, обитающих в Ку-чурганском водохранилище.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Объектами исследования служили половозрелые особи пяти видов рыб, отловленные в Кучур-ганском водохранилище (46° с.ш. 30° в.д., Молдова) летом 2012 г.: бентофаги — карп Cyprinus carpio (длина 47.4 ± 0.9 см, масса 2045 ± 64 г) и карась Carassius carassius (32.4 ± 1.1 см, 652 ± 56 г), ихтиофаги—факультативные бентофаги — окунь Perca fluviatilis (20.0 ± 0.8 см, 127 ± 11 г) и солнечник Le-pomis gibbosus (13.3 ± 0.4 см, 69 ± 4 г), типичный ихтиофаг — судак Zander lucioperca (29.6 ± 0.9 см, 412 ± 26 г).
В качестве ферментативно активных препаратов использовали слизистую оболочку кишечника, химус, а также культуры микрофлоры, выделенной из химуса. Кишечник рыб изымали из полости, помещали на стекло ледяной бани, освобождали от жира, осушали фильтровальной бумагой и разрезали вдоль. Химус аккуратно собирали при помощи специального скребка и небольшого стеклянного шпателя (5 мм). Затем специальным скребком снимали слизистую оболочку кишечника. Материал от пяти особей (без учёта пола) объединяли и тщательно перемешивали. Пробы слизистой оболочки или химуса гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с небольшим количеством раствора Рингера для холоднокровных животных (103 ммоль/л NaCl, 1.9 ммоль/л KCl, 0.45 ммоль/л CaCl2, 1.4 ммоль/л MgSO4, рН 7.0) при температуре 0—4°С. Гомогенаты разводили раствором Рингера до соотношения 1 : 99. После этого аликвоты гомогената доводили до соответствующего уровня рН (от 5 до 10 с интервалом 1) при помощи рН-метра марки рХ-150МИ.
При сборе материала для микробиологического анализа содержимого кишечника рыб руководствовались методикой Матейса (Mattheis, 1964). Исследуемых рыб промывали в стерильной воде и осушали, затем вскрывали (по возможности живыми). Чтобы не допустить изменений микрофлоры и потерь содержимого, на кишечник предварительно накидывали лигатуры. Содержимое кишечника 3—5 рыб помещали в стерильную посуду и формировали одну пробу согласно методу смешанных проб Рихтера-Отто и Фермана (Richter-Otto, Fehrmann, 1956). Из полученной средней пробы химуса отбирали 1 мл разведённого в 1000 раз химуса, который сеяли на 100 мл жидкой питательной среды (мясо-пептонный бульон). При таком разведении активность гидролаз консумен-та практически сводилась к нулю. Культивирование проводили в колбах с пробоотборниками в термостате при 28°С в течение 48 ч при регулярном перемешивании.
Активность протеиназ оценивали по приросту тирозина с помощью метода Ансона (Anson, 1938) в некоторой модификации. В качестве субстрата использовали 1%-ный раствор казеина, приготовленный на том же растворе Рингера, рН 5—10 (интервал 1). Гомогенаты и субстрат инкубировали при 20°C в течение 30 мин. Интенсивность окраски оценивали при помощи фотоколориметра КФК-2 (длина волны 587 нм). Активность ферментов в каждой точке определяли в пяти повтор-ностях с учётом фона (исходное количество тирозина в пробе) и выражали в мкмоль/(г-мин).
Результаты обработаны статистически при помощи стандартного пакета программ (Microsoft Office XP приложение Excel) и приведены в виде средней и ошибки среднего. Достоверность различий оценивали при помощи критерия Стью-дента для малых выборок прир < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Данные, касающиеся протеолитической активности слизистой оболочки кишечника и химуса у рыб, обитающих в Кучурганском водохранилище, свидетельствуют о некоторых видовых различиях в величине показателя (табл. 1). Достоверно (р < < 0.001) более высокая активность по сравнению с другими видами рыб отмечена у солнечника, меньшая — у карася и карпа, минимальная — у окуня и судака. При этом почти у всех исследованных видов рыб уровень протеолитической активности в слизистой оболочке ниже, чем в химусе. Отношение активности протеиназ слизистой оболочки к суммарной активности протеиназ у карпа, судака и солнечника различается незначительно, у карася величина данного коэффициента несколько выше, чем у этих рыб, у окуня — ниже.
Таблица 1. Протеолитическая активность слизистой оболочки кишечника и химуса (рН 7.4) у исследованных видов рыб Кучурганского водохранилища
Вид Слизистая Химус Суммарная активность, мкмоль/(г • мин)
мкмоль/(г • мин) % мкмоль/(г • мин) %
Карп 4.72 ± 0.15 46.3 5.47 ± 0.32 53.7 10.19 ± 0.22
Карась 8.02 ± 0.45 57.4 5.96 ± 0.36 42.6 13.98 ± 0.40
Речной окунь 3.74 ± 0.20 38.4 6.00 ± 0.26 61.6 9.74 ± 0.22
Судак 3.76 ± 0.24 44.4 4.70 ± 0.24 55.6 8.46 ± 0.24
Солнечник 8.86 ± 0.42 48.5 9.40 ± 0.50 51.5 18.26 ± 0.45
Таблица 2. Соотношение активности протеиназ слизистой кишечника и химуса (Пс/Пх) у исследованных видов рыб Кучурганского водохранилища
Вид Значения рН
5 6 7 8 9 10
Карп 0.95 0.78 0.78 0.96 0.88 0.79
Карась 0.86 1.3 1.3 1.39 1.27 1.1
Окунь 0.86 0.48 0.53 0.74 0.93 0.73
Судак 0.61 0.62 0.76 0.80 0.83 0.87
Солнечник 1.89 1.11 0.94 0.95 0.97 0.91
По данным опытов по изучению влияния рН на протеолитическую активность слизистой оболочки кишечника, у всех исследованных видов рыб минимальные значения зарегистрированы при рН 5, максимальные — при рН 10 (рисунок). Однако степень увеличения активности протеи-наз в тестируемом диапазоне рН у рыб с разным типом питания не одинакова. У бентофагов и ихтиофага значение этого показателя при рН 5 составляет о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.