связанные с установлением их аминокислотной последовательности и привлечением методов молекулярного моделирования, механизмы структурно-функциональной изменчивости (пластичности) по-ринов и особенности молекулярной организации этих белков в функционально активном состоянии изучены недостаточно. В связи с этим изучение конформации и функциональной активности пори-нов во взаимосвязи с изменениями условий окружающей среды по-прежнему вызывает интерес исследователей.
Данная работа посвящена изучению динамических свойств порообразующего белка из НМ Yersinia pseudotuberculosis (иерсинина), а именно, изменению конформации и функциональных свойств белка под действием рН. В эксперименте были использованы тримеры иерсинина, выделенные экстракцией SDS, как описано ранее [6]. Изменения в третичной и вторичной структуре порина, происходящие под влиянием рН, определяли методами флуоресцентной спектроскопии и кругового дихроизма (КД). С помощью электрофореза в полиакри-ламидном геле в присутствии SDS (SDS, ПААГ-электрофорез) оценивали изменение молекулярной структуры иерсинина. Технику бислойных ли-пидных мембран (БЛМ) использовали для анализа изменений функциональной активности иерсинина.
Как показано ранее [7], иерсинин относится к неспецифическим Omp F-подобным поринам НМ грамотрицательных бактерий. Подобно другим поринам, он является интегральным белком с высоким содержанием суммарной ^-структуры. Количественный расчет элементов вторичной структуры иерсинина по спектрам КД [8] показал, что на долю антипараллельных ^-складчатых слоев приходится до 60%, а на долю ^-изгибов - до 20% от общего состава элементов вторичной структуры порина. Иерсинин содержит значительное количество кислых аминокислот, таких, как аспара-гиновая и глутаминовая [9]. Индекс полярности белка, рассчитанный по методу Капальди [10], т.е. сумма молярных процентов полярных аминокислот и полусумма аминокислот, занимающих промежуточное положение между полярными и гидрофобными, равен 43% . Относительное содержание ароматических аминокислот в молекуле иерсинина достаточно высокое, около 13% [9]. Согласно данным по первичной структуре белка, мономер порина содержит три остатка триптофана и 26 остатков тирозина [9]. Два остатка триптофана находятся в Р-барреле, а один локализуется во внешней петле L3, расположенной в полости поры [11].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Приготовление образцов порина. Для изучения изменений в структуре и функциях белка образцы иерсинина (20, 50 и 150 мкг/мл для оптических методов и 5-10 нг/мл для реконструкции в
БЛМ) в растворе с определенным значением рН готовили в 10 мМ фосфатно-цитратном буфере, выдерживая в течение ночи перед измерениями. Концентрацию белка в растворе определяли по УФ-спектрам в максимуме поглощения при 280 нм,
принимая А010 равной 1.27 (значение молярной экстинкции порина определено экспериментально). УФ-спектры регистрировали при 25°С на спектрофотометре Specord М-40 ("Carl Zeiss Jena", Германия) в кварцевых кюветах длиной оптического пути 1 см.
Спектры флуоресценции иерсинина измеряли на спектрофлуориметре Hitachi 850 (Япония) в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см. Возбуждение флуоресценции проводили при 280 и 296 нм. Спектры флуоресценции, скорректированные по родамину В ("Wako Pure Chemical Industries", Япония), регистрировали, вычитая раманов-скую полосу буфера. Ширина щели на монохрома-торах возбуждения и излучения - 5 нм.
Спектры КД иерсинина регистрировали на спектрополяриметре Jasco J-500A (Япония) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 0.1 см для пептидной области спектра и 1 см - для ароматической. В пептидной области спектра КД (190240 нм) эллиптичность [0] считали как эллиптичность среднего остатка, принимая молекулярную массу последнего равной 110 Да и содержание белка равным 100%, по формуле:
[0] = [0]набл^110/(10С/) (град см2/дмоль),
где S - чувствительность шкалы прибора; C - концентрация белка (мг/мл); l - длина оптического пути (см). В ароматической области спектра КД (240-320 нм) эллиптичность [0]М считали как молярную, принимая молекулярную массу белка равной 110 кДа (молекулярная масса тримера порина из Y. pseudotuberculosis). Калибровку шкалы спек-трополяриметра проводили по 0.06% водному раствору аммониевой соли 10-сульфонат-^-камфор-ной кислоты ("Katayama Chemical", Япония). Отношение эллиптичностей полос при 192 и 290 нм составляло 2.09. Содержание элементов вторичной структуры белка рассчитывали по методу Провенчера [12].
Эксперименты в БЛМ. БЛМ формировали на отверстии тефлонового стаканчика диаметром 0.25 мм из 1% раствора 1-олеоилглицерина ("Sigma", США) в н-гептане. Водная фаза содержала 0.1 М NaCl (марки ос.ч.), 10 мМ фосфатно-цитрат-ный буфер с заданным значением рН и порин (5 нг/мл). Электрические измерения проводили в режиме фиксации напряжения, используя хлорсе-ребряные электроды, электрометрический усилитель ВК2-16 и самописец КСП-4, по стандартной методике [7]. Измерения проводили при комнатной температуре.
РЕЗУЛЬТАТЫ
SDS, ПААГ-электрофорез. С помощью SDS, ПААГ-электрофореза мы проследили за изменением молекулярной структуры иерсинина при изменении рН среды от 8.0 до 2.0 (рис. 1). Оказалось, что уже при рН 4.5 наряду с тримерной формой иерсинина в образце присутствует мономер белка, а при рН 3.5-2.0 иерсинин существует только в мономерной форме. Значение кажущейся молекулярной массы мономера составляет около 40 кДа, что, как показано нами ранее [6], соответствует молекулярной массе денатурированного мономера иерсинина.
На основании этих данных можно утверждать, что при увеличении концентрации ионов Н+ в растворе порина происходит диссоциация его триме-ров. Поскольку в результате образуется денатурированная мономерная форма, скорее всего, постепенное разрушение целостности тримера порина сопровождается одновременной денатурацией составляющих его мономеров.
Об этом же свидетельствует изучение термостабильности иерсинина при различных значениях рН с помощью сканирующей микрокалориметрии. Как показали наши исследования, при рН 7.6 иерсинин имеет четко выраженный термопереход при температуре 75°С (данные не приведены). При нагревании раствора порина при рН 3.5 и 2.2 характерное плавление образцов не наблюдалось. В связи с этим можно предположить, что изменения
123456789
кДа
ш
щ — 94
— 67
— 43
— 30
— 20
Рис. 1. 8Б8, ПААГ-электрофорез образцов иерсинина, полученных при рН-титровании: 1 - рН 8.0; 2 - рН 7.0-6.0; 3 - рН 5.0; 4 - рН 4.5; 5 - рН 4.0; 6 - рН 3.5; 7 -рН 3.0; 8 - рН 2.5; 9 - рН 2.0 8.0; белки-маркеры (М, кДа): ингибитор трипсина (20.1), карбоксиангидра-за (30), яичный альбумин (43), бычий сывороточный альбумин (67), фосфорилаза В (94).
в пространственной структуре иерсинина под действием кислоты приводят к значительным нарушениям молекулярной организации порина на уровне третичной структуры.
Собственная белковая флуоресценция иерсинина. В интервале значений рН 8.0-2.0 в спектре флуоресценции иерсинина происходят определенные изменения, свидетельствующие о том, что при рН-титровании белок образует целый ряд переходных конформационных состояний. Суммарный спектр (^возб = 280 нм) собственной флуоресценции изолированного тримера иерсинина при рН 8.0-7.5 имеет максимум при 322 ± 2 нм, а положение максимума спектра излучения остатков триптофана (^возб = 296 нм) в белке соответствует 332 ± 1 нм. Коротковолновое положение максимума спектра флуоресценции исследуемого порина указывает на то, что остатки триптофана в слабощелочных растворах белка находятся в гидрофобном окружении [13]. Различие в положении максимумов спектров триптофанового и суммарного излучения порина указывает на существенный вклад в излучение остатков тирозина, а также на то, что часть остатков тирозина не участвует в переносе энергии на остатки триптофана и находится на значительном расстоянии от них [14].
Относительная величина максимальной интенсивности флуоресценции иерсинина при разных длинах волн возбуждения при изменении рН от 8.0 до 2.0 уменьшается синхронно и волнообразно с минимумом при рН 4.5 (рис. 2, кривые 1, 2). Это позволяет выделить две области изменения параметров флуоресценции: в интервале значений рН 8.0-5.0 (со средней точкой при рН 6.5-6.0) и при рН 4.0-2.0 (со средней точкой при рН 3.5-3.0). Наблюдаемые изменения интенсивности излучения порина отражают различие в структурном состоянии белка в этих интервалах значений рН, которое обусловлено различной величиной общего заряда белка. При рН 7.5-4.5 интенсивность триптофано-вой флуоресценции уменьшается без сдвига максимума спектра (рис. 2, кривые 2, 4). В этой области рН при возбуждении 280 нм наблюдается коротковолновый сдвиг суммарных спектров излучения от 322 до 320 нм (рис. 2, кривая 3), что означает увеличение относительного вклада тирозиновой флуоресценции в суммарный спектр, что, возможно, связано с уменьшением миграции энергии с тиро-зиновых остатков на триптофановые.
Максимальная интенсивность флуоресценции белка наблюдается при рН 6.5-5.5. В кислой области значений рН (4.5-2.0) сначала наблюдается увеличение относительной максимальной интенсивности излучения иерсинина (при уменьшении рН от 4.5 до 3.0), а затем при рН 2.0 - ее уменьшение (рис. 2, кривые 1, 2). В этой области рН в спектрах триптофановой флуоресценции наблюдается длинноволновый сдвиг от 332 до 337 нм (рис. 2, кри-
вая 4) и увеличение интенсивности относительно интенсивности при рН 4.5 (рис. 2, кривые 1, 2). В этой области рН положение максимума суммарного спектра сдвигается в коротковолновую область до 315 нм, т.е. относительный вклад в излучение тирозиновых остатков увеличивается. Изменение заряда карбоксильных групп молекулы порина (связанное с изменением степени ионизации кислых аминокислотных остатков в белке) приводит к увеличению подвижности окружения остатков триптофана и доступности их молекулам воды (длинноволновый сдвиг положения максимума спектра) и уменьшению тушения флуоресценции тирозиновых остатков. Это связано с более значительными нарушениями в локальной третичной структуре иерсинина - диссоциации тримера бе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.