БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 2, с. 159-168
УДК 577.112' 314.6.083
ВЛИЯНИЕ рИ ИА СТРУКТУРУ И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ПОРИНА ИЗ НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ Yersinia pseudotuberculosis. 2. ХАРАКТЕРИСТИКА рИ-ИНДУЦИРОВАННЫХ КОНФОРМАЦИОННЫХ ИНТЕРМЕДИАТОВ ИЕРСИНИНА#
© 2007 г. О. Д. Новикова, Н. Ю. Ким, П. А. Лукьянов, Г. Н. Лихацкая, В. И. Емельяненко*, Т. Ф. Соловьева
Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, 690022 Владивосток, просп. 100 лет Владивостоку, 159; электронная почта: novolga_05@mail.ru *Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142292 Пущино, Московская область; электронная почта: emelyane@rambler.ru
Поступила в редакцию 19.06.2006 г.
Методами флуоресцентной спектроскопии, кругового дихроизма (КД) и спектроскопии флуоресцентных зондов охарактеризованы рН-индуцированные интермедиаты Omp F-подобного порина из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis (иерсинина). Конформационные превращения иер-синина под действием рН могут быть описаны трехступенчатой моделью: 1) разрушение ассоциатов порина с образованием тримеров белка; 2) независимые изменения в отдельных структурных доменах порина с последующей диссоциацией тримера на мономеры; 3) образование двух форм мономерных интермедиатов порина с разрыхленной структурой. Предполагается, что одна из мономерных форм (при рН 3.0) соответствует состоянию белка, подобному расплавленной глобуле, а вторая представляет собой частично денатурированный мономер порина, в котором сохраняется только 50% регулярной вторичной структуры. С использованием теоретической модели пространственной структуры иерсинина обсуждается возможный механизм разрушения структуры Р-барреля порина под действием рН.
Неспецифические порины наружной мембраны (НМ) грамотрицательных бактерий, образующие трансмембранные поры для пассивной диффузии гидрофильных низкомолекулярных веществ, подобно другим интегральным мембранным в-струк-турированным белкам, отличаются высокой степенью конформационной изменчивости (пластичности) на уровне их четвертичной и третичной структуры [1]. Под действием различных факторов, в том числе влияющих на электростатические свойства поринов, они способны образовывать множество конформационных интермедиатов, отличающихся степенью упорядоченности пространственной организации молекулы [2, 3]. Это свойство обусловливает динамичное поведение поринов в НМ бактерий и является одним из механизмов адаптации бактерий к изменению условий окружающей среды, поскольку конформация по-
^Сообщение 1 см.: Ким Н.Ю., Новикова О.Д., Хоменко В.А., Лихацкая Г.Н., Вострикова О.П., Емельяненко В.И., Кузнецова С.М., Соловьева Т.Ф. Влияние рН на структуру и функциональную активность порина из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis. 1. Функционально значимые конформационные переходы иерсинина // Биол. мембраны. 2007. Т. 24. < 2. С. 150-158.
рина напрямую связана с функциональным состоянием поры [4, 5].
Как известно, стабильность белка может значительно изменяться при повышении концентрации ионов Н+ в растворе, поэтому рН-титрование широко используется для изучения процесса дестабилизации нативной структуры белка. Для поринов характерно высокое содержание полярных аминокислот и, как следствие, большое число заряженных групп, что объясняет возможность рН-зависимых структурных переходов в молекулах этих белков [6]. Опубликован целый ряд работ, показывающих рН-зависимость функциональной активности поринов [7-9]. Так, отмечено влияние рН на кооперативность включения каналов [7] и на размер пор [8, 9]. Тодт и соавт. [9] обнаружили существование двух и более рН-зависимых субсостояний "открытого" канала, соответствующих различным конформациям молекулы порина.
Цель данной работы состояла в изучении изменений пространственной структуры порообразую-щего белка из НМ Yersinia pseudotuberculosis (иерсинина) под действием рН. Физико-химические характеристики отдельных рН-индуцированных интермедиатов иерсинина получены с помощью
I, отн ед.
Рис. 1. Спектры флуоресценции тримера порина из Y. pseudotuberculosis при рН 7.5, полученные при возбуждении 280 нм (1), при возбуждении 296 нм (2). 3 -Спектр излучения остатков тирозина (разностный спектр).
флуоресцентной спектроскопии и кругового дихроизма (КД).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Приготовление образцов порина и условия измерения спектров КД и собственной флуоресценции белка приведены в сообщении 1. Содержание элементов вторичной структуры иерсинина рассчитывали с помощью пакета программ CDPro [10].
Эксперименты по тушению флуоресценции иерсинина. К 1 мл раствора белка (50 мкг/мл) в содержащем 0.15 М NaCl 10 мМ трис-цитратном буферном растворе (буфер А), предварительно инкубированного в течение ночи при определенном значении рН (от 2.0 до 8.0), добавляли 1 М CsCl и 1 М KI в соответствующем буфере А (до конечной концентрации тушителей в кювете 0.01 М) или 1 мМ диметиламинохалкон (ДМХ) и bN-фенил-аминонафталин (ФАН) в этаноле. После инкубации в течение 10 мин при постоянном перемешивании регистрировали флуоресценцию белка при 335 нм и при возбуждении светом с длиной волны 296 нм (ширина щели соответственно 8 и 2 нм) с использованием встроенного фильтра (310 нм). Константы Штерна-Фольмера рассчитывали по формуле, приведенной в [11].
Исследование флуоресценции пирена в присутствии иерсинина. К 1 мл раствора белка (20 мкг/мл) в буфере А с соответствующим значением рН добавляли 1 мМ раствор пирена в этаноле (1 мкл). Спектр пирена снимали в области 360-400 нм при облучении светом с длиной волны 340 нм (ширина щели 1 нм) после инкубации образца в течение ночи при 25°С в темноте. Аналогично проводили эксперимент в присутствии мочевины в различных концентрациях. Предвари-
тельные опыты по подбору соотношения бе-лок/пирен проводили, как описано в работе [12].
Определение доступности и контактов остатков триптофана в молекуле иерсинина. Модель пространственной структуры мономера иерсинина (код аминокислотной последовательности Genbank AY855840) получена методом сравнительного моделирования с помощью сервера SWISS-MODEL [13] с использованием кристаллической структуры мономера порина Pho E Escherichia coli (код PDB 1PHO) в качестве прототипа. Структура тримера иерсинина получена с помощью программы SPDBV [14] с использованием структуры тримера Omp F E. coli (код PDB 2OMF) в качестве прототипа, согласно [15]. Локализацию остатков тирозина и триптофана определяли с помощью программы Rasmol [16]. Контакты остатков триптофана и их доступность в мономере и тримере порина анализировали соответственно с помощью программ Molmol и MOE [17]. Визуализацию молекул осуществляли с помощью программ SPDBV [14] и Rasmol [16].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Изменение пространственной структуры иерсинина под действием рН. Собственная белковая флуоресценция иерсинина. Ранее мы отмечали (сообщение 1), что характерной особенностью суммарной эмиссии иерсинина является существенный вклад флуоресценции тирозина. На рис. 1 приведены спектры флуоресценции иерсинина при рН 7.5 и обеих длинах волн возбуждения (280 и 296 нм), нормированные таким образом, чтобы в длинноволновой части формы спектров совпадали, поскольку при X > 370 нм вклад флуоресценции тирозина отсутствует, а вклад трипто-фанилов не изменяется. Полученная разница в спектрах соответствует вкладу флуоресценции тирозина в суммарное излучение белка.
При исследовании изменений в пространственной структуре иерсинина под действием рН мы определили точки наиболее выраженных изменений в спектрах его собственной флуоресценции, которые, по нашим представлениям, соответствовали отдельным конформационным состояниям молекулы порина. При анализе изменений относительных вкладов ароматических флуорофоров в суммарную эмиссию конформационных интерме-диатов при изменении рН раствора порина оказалось, что при рН 6.5 относительные вклады в излучение остатков тирозина и триптофана равны 0.35 и 0.65 соответственно, при рН 3.0 доля излучения остатков тирозина составила 0.42, а триптофана 0.58.
Для более детальной характеристики рН-инду-цированных конформационных интермедиатов иерсинина использовали различные тушители трипто-
Рис. 2. Зависимость констант тушения собственной флуоресценции иерсинина различными тушителями от рН среды. В качестве тушителей флуоресценции использованы: иодистый калий (а), хлористый цезий (б), диметиламинохалкон (в), 1-^фениламинонафталин (г). Интенсивность флуоресценции белка измеряли при 335 нм и облучении светом с длиной волны 296 нм (ширина щелей 8 и 2 нм) с использованием встроенного фильтра (310 нм).
фановой флуоресценции белка и спектроскопию флуоресцентных зондов [11]. Для определения способа разворачивания полипептидной цепи порина в процессе денатурации при изменении рН среды использовали теоретическую модель тримера иерсинина и результаты расчетов по спектрам КД отдельных конформационных интермедиатов порина.
Тушение флуоресценции иерсинина с помощью ионных и гидрофобных акцепторов флуоресценции. С помощью тушителей различной природы (ионных и гидрофобных) мы изучили микроокружение остатков триптофана в иерсинине, изменяющееся под влиянием рН среды (рис. 2). Как видно из рис. 2, кривые зависимости констант тушения от рН, полученные при взаимодействии иерсинина как с ионными, так и с гидрофобными тушителями, при рН около 4.5 проходят соответственно через минимум или максимум. Это свидетельствует об образовании у иерсинина в этой области значений рН некоего переходного конформационного состояния. Судя по величине констант Штерна-Фольмера (рис. 2а,б), при рН 4.5 остатки триптофана в образце порина характеризуются малой до-
ступностью для ионов цезия и иода. Тем не менее, значение Ктуш для иодистого калия примерно в 6 раз выше, чем для хлористого цезия, т.е. в окружении остатков триптофана в белке при этом значении рН преобладают положительно заряженные группы.
В случае гидрофобных положительно заряженных акцепторов флуоресценции - ДМХ и ФАН (рис. 2в, г), в слабощелочной и кислой областях рН константы тушения флуоресценции порина этими тушителями соответственно в 2.5-3 раза выше, чем у инте
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.