ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2013, № 2, с. 133-137
БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ
УДК 577.218:595.773.4
ВЛИЯНИЕ РНК-ШПИЛЬКИ, СПЕЦИФИЧНОЙ К ГЕНУ lawc, НА ЭКСПРЕССИЮ ПЕРЕКРЫВАЮЩИХСЯ ГЕНОВ КОМПЛЕКСА
lawc/Trf2 У D. melanogaster
© 2013 г. Р. О. Черезов*, Ю. Е. Воронцова*, И. Б. Мерцалов**, Д. А. Куликова*, О. Б. Симонова*
* Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26 **Институт биологии гена РАН, 119334Москва, ул. Вавилова, 34/5 E-mail: osimonova@hotmail.com Поступила в редакцию 26.09.2012 г.
Использована генетическая система генного комплекса leg-arista-wing complex/TBP related factor 2 (Iawc/Trf2) в качестве удобной модели для исследования in vivo особенностей работы разнонаправленных перекрывающихся генов. Созданы линии трансгенных дрозофил, несущих конструкции, способные экспрессировать РНК-шпильку, направленную на посттранскрипционное подавление мРНК гена lawc по пути РНК-интерференции. Попытка искусственного подавления lawc-тран-скриптов вызвала повышение уровня экспрессии гена lawc в несколько раз. Показано, что изменение концентрации lawc-транскриптов может влиять на концентрацию транскриптов Trf2. Обсуждаются возможные механизмы регуляции экспрессии исследуемых перекрывающихся генов.
DOI: 10.7868/S0002332913020045
Последние исследования показали, что геномы эукариотических организмов кодируют множество антисмысловых транскриптов, содержащих последовательности, комплементарные другим эндогенным РНК (Lagos-Quintana et al., 2001; Lavorgna et al., 2004; Munroe, Zhu, 2006). В основном их идентифицируют и исследуют структуру и функции крупномасштабными биоинформати-ческими методами in silico (базы данных RefSeq, EST), а также с использованием разновидностей технологии ДНК-микрочипов (Johnson et al., 2005; Ge et al, 2006; Zhang et al, 2006). По современным данным роль естественных антисмысловых транскриптов связывают с процессами, регулирующими импринтинг, инактивацию X-хромо-сомы, процессинг РНК, экспорт РНК и регуляцию транскрипции (Ogawa, Lee, 2002; Car-michael, 2003; Shibata, Lee, 2004; Wassarman, 2004; Almeida, Allshire, 2005; Bernstein, Allis, 2005; Ringrose, Para, 2007; Soshnikova, Duboule, 2008). Число исследований, направленных на оценку количества и разнообразия антисмысловых тран-скриптов in silico, быстро возрастает, но, к сожалению, эксперименты, направленные на выяснение функции и физиологической значимости этих транскриптов in vivo, пока малочисленны (Dahary et al., 2005; Timmons, Good, 2007; Beiter et al, 2009).
Для исследования особенностей регуляции перекрывающихся генов in vivo мы использовали генный комплекс leg-arista-wing complex/TBP re-
lated factor 2 (lawc/Trf2), представляющий собой два противоположно направленных гена, транскрипты которых частично перекрываются. Оба гена кодируют белки, контролирующие развитие (Brandt, Corces, 2008; Raben_stein et al, 1999). Таким образом, использование генного комплекса leg-aris-ta-wingcomplex/TBPrelatedfactor2 (lawc/Tf2) в качестве модели исследования перекрывающихся генов, позволит нам изучить влияние взаимодействия этих генов на развитие организма.
Цель исследования — выяснить, влияет ли подавление экспрессии мРНК гена lawc на функционирование противоположно направленного гена Tf2, а также установить характер влияния нарушения экспресии этих перекрывающихся генов на развитие организма. В результате нами было показано, что РНК-шпилька, направленная на подавление экспрессии гена lawc, вызывает активацию его транскрипции, при этом уровень экспрессии гена Trf2 снижается, нарушая развитие организма.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для изучения регуляторной роли транскриптов гена lawc комплекса lawc/Trf2 были созданы линии трансгенных дрозофил, несущих конструкции, способные экспрессировать РНК-шпильку, направленную на посттранскрипционное подавление мРНК гена lawc по пути РНК-интерференции. Для этого на основе вектора pUAST (Brand, Perimon, 1993) получили конструкции
134
ЧЕРЕЗОВ и др.
□ 1 ■ 2
□ 3
3'
„
"
lawc
' rev ■ > < rev > .
II EcoRl'-•- Xhol EcoRl. ■. Xhol
Xbal ■
dir
5xUAS EcoRl ______I_
■ Xhol Xbal-
dir
Xhol
Xhol
Xbal —I_
РНК-шпилька lawc
III Xbol
EcoRl dir rev
Ori 3'P
5 P
Рис. 1. Инактивирующие конструкции Ri и Rif, созданные для подавления lawc. I — геномная организация перекрывающихся генов lawc и Trf2. 1 — область перекрывающихся экзонов; 2 — районы, кодирующие белок; 3 — не кодирующие экзоны. II — фрагменты инактивирующей конструкции UAS-lawc-Ri (Ri) (слева) и UAS-lawc-Rif (Rif) (справа). Внизу — схема РНК-шпильки, которая начнет формироваться после активации конструкций в системе UAS/GAL4; III — карта плазмидpUAST-lawcRNAi(Ril/Rif), mini-white — маркерный ген; Ori — ориджин репликации; 3'Р, 5'Р — концевые повторы Р-элемента.
pUAST-3ЧawcRNAi (обозначенную Ri) и pUAST-5'lawcRNAi (обозначенную Rif), активация которых должна приводить к формированию РНК-шпильки, индуцирующих посттранскрипционное подавление мРНК гена lawc по пути РНК-интерференции. Каждая конструкция содержала по два фрагмента транскрибируемой области гена lawc (транслируемой или нетранслиру-емой в зависимости от дизайна конструкции), клонированных в направлении голова к голове по отношению друг к другу под контролем дрожжевого индуцибельного промотора ЦЛ8 (рис. 1). ДНК полученных конструкций была инъецирована в полярную плазму эмбрионов дрозофилы на стадии прецеллюлярной бластодермы. Полученные линии трансгенных дрозофил (UAS-lawc-Ri и UAS-lawc-Rif) использовались в генетических экспериментах с применением дрожжевой двух-компонентной системы ЦЛ8/ОЛЬ4. Для этого мухи, экспрессирующие дрожжевой белок-активатор Оа14 под контролем убиквитарного промотора гена тубулина ШЬ^а14/ТМ3, ТЬ, были скрещены с трансгеннными мухами UAS-lawc-Ri(Rif), несущими инактивирующую конструкцию, контролируемую дрожжевым промоторным элементом ЦЛ8. В результате белок Оа14 получал доступ к своим сайтам связывания (ЦЛ8) и повсеместно активировал экспрессию инактивирующей кон-
струкции в организме мухи tub-Gal4/UAS-lawc-Ri(Rif). В качестве контроля активации конструкций использовались трансгенные мухи UAS-lawc-Ri и UAS-lawc-Rif без белка-активатора Оа14.
Восстановление жизнеспособности (ге8еие-тест) проводили генетическими методами, используя две трансгенные линии дрозофил, конститутивно экспрессирующие различные изо-формы ТИР2 (Воронцова и др., 2007). Для исследования фенотипа погибших эмбрионов хорион удаляли вручную, кутикулу просветляли в капле раствора Хойера с добавлением 30% молочной кислоты в течение 1 ч при 60°С (ЛзИЪигпег, 1989).
Сравнительный анализ экспрессии генов lawc и 2 проводили методом количественной поли-меразнои цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с использованием зондов, меченных флуоресцентными красителями (зонды TaqMan®). Праймеры подбирались из транслируемых областей обоих исследуемых генов. В качестве эндогенного референсного гена использовался ген ри-босомального белка Rpl19.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Активация конструкции Ri привела к резкому снижению жизнеспособности дрозофил
ВЛИЯНИЕ РНК-ШПИЛЬКИ, СПЕЦИФИЧНОЙ К ГЕНУ lawc
135
%
100 80 60 40 20
□ 7 Ш □
23 25 27 25 25
Температура, °C
Рис. 2. Выживаемость дрозофил после активации конструкции Ri белком Gal4, экспрессирующегося под контролем промотора гена тубулина (Tub-Gal4 > UAS-Ri) при различной температуре развития (1), выживаемость (Rescue-test) на фоне эктопической экспрессии двух изоформ белка TRF2: укороченной (2) и полноразмерной (3). По оси ординат — частота выживаемости.
иАЗ-1ам!с-Ш/ШЬ-0АЪ4 (рис. 2). Исследование фенотипа погибших эмбрионов показало наличие у них ряда аномалий, характерных для эмбрионов со сниженным уровнем содержания белка ТИР2 (рис. 3). Нарушения у эмбрионов проявлялись
либо в их неправильной сегментации (фенотип "двойная линия" ("double line" — стрелки на рис. 3б)), либо в отсутствии кутикулярных структур тела: фенотип "призрак" ("ghost" на рис. 3в). Было много эмбрионов, у которых не происходило слияния фрагментов трахей в единую сеть на финальных этапах ее формирования, что приводило к нарушению целостности дыхательной системы (рис. 3г). Введение дополнительных конструкций, экспрессирующих TRF2, восстанавливало жизнеспособность мух, обосновывая тот факт, что эмбриональная гибель в трансгенных линиях действительно является результатом снижения уровня экспрессии Trf2 (рис. 2). Таким образом, мы получили неожиданный результат: направленная на подавление экспрессии lawc конструкция Ri привела к значительному снижению экспрессии перекрывающегося с ним гена Trf2. Данные генетических экспериментов были подтверждены в сравнительном анализе экспрессии генов lawc и Trf2, выполненном с помощью метода ПЦР-РВ (рис. 4). Оказалось, что у мух после активации конструкции Ri уровень экспрессии Trf2 действительно резко снижается, в то время как экспрессия lawc увеличивается более чем в 2 раза по сравнению с мухами, содержащими неактивную конструкцию Ri. Следовательно, попытка снизить экспрессию lawc-транскриптов привела к обратному эффекту. Возможно, сначала активация Ri все-таки вызвала снижение синтеза белка LAWC, что привело к включению неких компенсаторных механизмов, усиливающих
0
Рис. 3. Фенотип эмбрионов, погибших после подавления экспрессии транскриптов lawc комплекса lawc/Trf2. a — эмбрион дрозофилы дикого типа (вид с латеральной стороны): А, Р — передний и задний полюса эмбриона соответственно, А1—А8 — абдоминальные сегменты; (б—г) — фенотипы эмбрионов, погибших в результате активации конструкции Ri белком Gal4, экспрессирующегося под контролем промотора гена тубулина (Tub-Gal4 > UAS-Ri); б — фенотип "Double-line". Стрелки — зубчатые полоски в виде двойных линий, характеризующие данный фенотип; в — фенотип "Ghost"; г — нарушение формирования трахейной системы. Стрелки — разрывы трахей.
136
ЧЕРЕЗОВ и др.
□ 1 □ 2
Контроль
á
RQ
2.5
2.0 1.5 1.0 0.5
0
Рис. 4. Экспрессия генов Тг{.2 (1) и 1ам>е (2) до активации (контроль) и после активации конструкции Ri. КО — относительный уровень экспрессии мРНК. Контроль — уровень экспресси
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.