ВОДНАЯ ТОКСИКОЛОГИЯ
УДК 597-113:574.64
ВЛИЯНИЕ РТУТИ НА АКТИВНОСТЬ ГЛИКОЗИДАЗ В КИШЕЧНИКЕ ОКУНЯ Perca fluviatilis L. ИЗ ВОДОЕМОВ ЕВРОПЕЙСКОЙ РОССИИ С РАЗНЫМ pH ВОДЫ
© 2012 г. И. Л. Голованова, Г. А. Пенькова, В. А. Гремячих, В. Т. Комов
Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, 152742 пос. Борок, Ярославская обл., Некоузский р-н, e-mail: golovan@ibiw.yaroslavl.ru Поступила в редакцию 09.03.2011 г.
У окуня из водоемов Европейской России с разным уровнем рН воды выявлены разнонаправленные изменения активности кишечных гликозидаз и кинетических характеристик гидролиза углеводов по мере накопления Н в мышцах. У рыб из водоемов с нейтральным значением рН воды с ростом содержания Н (0.05—0.30 мг на 1 кг сырой массы) амилолитическая активность снижается, активность сахаразы возрастает. Снижение константы Михаэлиса гидролиза углеводов отражает адаптивное увеличение фермент-субстратного сродства. У рыб из ацидных озер накопление Н в мышечной ткани составляет 0.18—0.86 мг на 1 кг сырой массы. С ростом ее содержания активность гликозидаз и фермент-субстратное сродство в большинстве случаев снижаются, негативно влияя на скорость ассимиляции углеводных компонентов пищи.
Ключевые слова: окунь, пищеварительные гликозидазы, ртуть, ацидификация.
ВВЕДЕНИЕ
Водоемы северо-западной части России испытывают значительные антропогенные нагрузки. Ртуть рассматривается как один из самых опасных элементов, оказывающих токсическое действие на гидробионтов. Масштабы ее антропогенной эмиссии в атмосферу очень велики и соизмеримы с количествами, участвующими в природном глобальном цикле [18]. Мигрируя на большие расстояния и попадая в водоемы, она может представлять угрозу экосистемам и здоровью населения. Высокие концентрации Н (1—3 мг/кг) неоднократно регистрировались в мышцах рыб из водоемов Северо-Запада России [10, 16]. Доминирующий фактор в повышении биодоступности Н при низком ее содержании в абиотических компонентах системы — закисление воды. Попав с атмосферными осадками в те водоемы, где низкие значения рН создают благоприятные условия для интенсивного протекания процессов метилирования, и пройдя по трофической цепи, Н аккумулируется в тканях рыб в концентрациях, значительно превышающих содержание металла в воде [14]. При этом до 99% Н в организме рыб находится в более токсичной метилированной форме [15]. Ртуть изменяет поведение рыб [22], оказывает мутагенные и тератогенные эффекты [11, 19], вызывает значительные изменения белкового, липидного и углеводного обменов [3, 8]. Вследствие этого снижается темп роста, нарушаются процессы созревания гонад и
воспроизводства. В организм рыб она поступает преимущественно с пищей [17], однако действие этого металла на пищеварительные ферменты рыб из природных популяций изучено недостаточно.
Поскольку углеводы играют важную роль в энергетическом и пластическом обмене организма, для оценки физиолого-биохимического состояния особую актуальность представляет изучение влияния накопленной в организме Hg на гидролиз углеводных компонентов корма. Для этой цели окунь — наиболее удобный объект исследования, поскольку как ихтиофаг он завершает трофическую цепь водоема, что наряду с низкой скоростью линейного роста способствует интенсивному накоплению Hg, особенно у рыб старших возрастных групп [7]. Окунь обитает фактически во всех водоемах, даже в озерах с рН воды <4.5. Кроме того, это один из самых популярных объектов спортивного и промыслового рыболовства.
Цель работы — исследование накопления и хронического действия Hg на активность глико-зидаз и кинетические характеристики гидролиза углеводов в кишечнике окуня Percafluviatilis L. из ряда водоемов Европейской России с нейтральным и кислым значениями рН воды.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Рыбы отловлены удочкой и ставными сетями в летне-осенний период 2002—2007 гг. из ряда водо-
Таблица 1. Активность гликозидаз и Кт гидролиза углеводов в кишечнике окуня с разным содержанием ртути в мышцах из водоемов с нейтральным значением рН воды (6.8—7.8)
Водоем рН Количество исследованных рыб, экз. Содержание Hg в мышцах, мг на 1 кг сырой массы Активность ферментов, мкмоль/(г • мин) Km гидролиза
амилоли-тическая сахаразы крахмала, г/л сахарозы, ммоль
Озера:
Хотавец 7.4 10 0.05 ± 0.02а 2.26 ± 0.05а 0.11 ± 0.01а 4.3 ± 0.2а 33.7 ± 5.9а
Татарское 7.8 10 0.08 ± 0.02а 1.45 ± 0.02б 0.17 ± 0.02а 1.4 ± 0.2в 13.8 ± 0.16б
Валдай, ст. 1 7.6 10 0.10 ± 0.02а 1.40 ± 0.03б 0.53 ± 0.03б 2.3 ± 0.1б 18.6 ± 0.12в
Дельта р. Волги 7.4 10 0.12 ± 0.01а 1.16 ± 0.08в 0.50 ± 0.01б,в 2.4 ± 0.1б 3.4 ± 0.3г
Моложский плес 7.5 10 0.21 ± 0.01б 1.55 ± 0.03б 0.43 ± 0.02в 3.1 ± 0.2г 4.3 ± 0.1г
Рыбинского водохранилища
Озера:
Полисто 6.8 8 0.29 ± 0.01в 1.61 ± 0.10б 0.29 ± 0.02г 3.2 ± 0.3г 9.4 ± 0.5д
Валдай, ст. 2 7.4 10 0.30 ± 0.01в 1.99 ± 0.06г 0.59 ± 0.02б 2.8 ± 0.2б,г 6.5 ± 0.3е
Примечание. Здесь и в табл. 2 приведены средние значения и их ошибки (М ± т); разные надстрочные индексы указывают на статистически значимые различия между показателями в столбце (ЛКО"УЛ, LSD-тест,р < 0.05).
емов Европейской России, расположенных на территории Астраханской (дельта р. Волги), Вологодской (оз. Дубровское, Мотыкино и Хота-вец), Новгородской (оз. Валдай, Корниловка, Ро-говское, Чудское, Малое Горецкое и Большое Го-рецкое), Рязанской (оз. Татарское), Псковской (оз. Полисто), Ярославской (Моложский плес Рыбинского водохранилища) областей, а также Республики Карелия (оз. Вегарусьярви). Средняя масса окуней из водоемов с нейтральным значением рН воды (6.8—7.8) составляла 80—130 г, длина тела 16—19 см, из ацидных водоемов (рН 4.5—5.3) — 20— 54 г и 11—16 см соответственно. После поимки рыб обездвиживали и проводили полный биологический анализ. Кишечники изымали и хранили <2 недель при температуре —18°С. Всего исследовано 68 экз. окуня из водоемов с нейтральным значением рН воды и 86 экз. — из ацидных водоемов.
В лабораторных условиях кишечник очищали от жира и прилегающих тканей и разрезали вдоль. C помощью специального пластмассового скребка удаляли химус. Слизистую оболочку кишечника промывали охлажденным до 2—4°С раствором Рингера для холоднокровных животных (110ммоль NaCl, 1.9 ммоль KCl, 13 ммоль CaCl2, рН 7.4), чтобы удалить остатки химуса. Затем кишечники осушали фильтровальной бумагой и пластмассовым скребком снимали слизистую оболочку медиальной части кишечника, которую использовали для приготовления исходного гомо-гената. Суммарные пробы слизистой оболочки кишечника от 8—12 рыб гомогенизировали с помощью стеклянного гомогенизатора, добавляя охлажденный до 2—4°С раствор Рингера в соотношении 1 : 9. Затем гомогенат дополнительно разводили раствором Рингера в 2—10 раз. Растворы субстратов (0.28—9% крахмала и сахароза в концентрации 12.5—200 ммоль/л) готовили на та-
ком же растворе. Гомогенаты и растворы субстратов инкубировали при постоянном перемешивании в течение 30 или 60 мин при температуре 20°С, рН 7.4.
Активность гликозидаз: сахаразы КФ 3.2.1.48, гидролизующей сахарозу, и амилолитическую активность, отражающую суммарную активность ферментов, гидролизующих крахмал (а-амилазы КФ 3.2.1.1, глюкоамилазы КФ 3.2.1.3 и мальтазы КФ 3.2.1.20), оценивали по приросту гексоз модифицированным методом Нельсона [13]. Ферментативную активность определяли в пяти по-вторностях с учетом фона и выражали в микромолях продуктов реакции, образующихся за 1 мин инкубации ферментативно-активного препарата и субстрата в расчете на 1 г влажной массы ткани (мкмоль/(г • мин)). Кинетические характеристики гидролиза крахмала и сахарозы — значения кажущейся константы Михаэлиса (Km) и максимальной скорости реакции (V), определяли графическим методом Лайнуивера—Берк. В тканях рыб Hg определяли атомно-абсорбционным методом с использованием анализатора А-915.
Данные обработаны статистически с помощью пакета прикладных программ Statgraphics Plus 5.1 и Excel 2003. Результаты представлены в виде средних и их ошибок (M ± m). Достоверность различий оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA, LSD-тест) при p = 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Водоемы с нейтральным рН воды. Содержание Hg в мышцах окуня варьировало от 0.05 мг/кг (оз. Хотавец) до 0.29—0.30 мг/кг (оз. Полисто и оз. Валдай, ст. 1) (табл. 1). С ростом накопления Hg амилолитическая активность снижается в 1.1—
Таблица 2. Активность гликозидаз и Km гидролиза углеводов в кишечнике окуня с разным содержанием Hg в мышцах (над чертой) и кишечнике (под чертой) из водоемов с кислым значением рН воды (4.5—5.3)
Озеро рН Количество исследованных рыб, экз. Содержание Hg, мг на 1 кг сырой массы Активность ферментов, мкмоль/(г • мин) Km гидролиза
амилолитиче-ская сахаразы крахмала, г/л сахарозы, ммоль
Роговское 5.3 10 0 .18 ± 0. 02 a 0.02 ± 0.001a 2.17 ± 0.08а 0.46 ± 0.01а 2.5 ± 0.1а 2.0 ± 0.1а
Корниловка 5.0 10 0 .2 3 ± 0. 01 a 0.07 ± 0.002б 2.09 ± 0.03а 0.50 ± 0.01а 4.1 ± 0.3б 5.5 ± 0.4б
Вегарусьярви 5.1 11 0 . 26 ± 0.0 2a' б 1.66 ± 0.05б 0.40 ± 0.02б 4.2 ± 0.2б 4.1 ± 0.3б
Чудское 5.4 10 0 .36 ± 0. 04б 0.05 ± 0.004б 2.03 ± 0.05а 0.36 ± 0.01б 3.3 ± 0.1в 2.6 ± 0.1в
Мотыкино 4.5 12 0 . 47 ± 0.0 3б' в 0.14 ± 0.01в 1.93 ± 0.07а,в 0.26 ± 0.02в 2.8 ± 0.2а 3.4 ± 0.5 б,в
Малое Горецкое 4.9 10 0 . 49 ± 0.0 2в 0.09 ± 0.001г 1.52 ± 0.01б 0.28 ± 0.01в 4.5 ± 0.1б 2.8 ± 0.1в
Дубровское 4.5 10 0 . 57 ± 0.04в 0.46 ± 0.05д 1.86 ± 0.03в 0.54 ± 0.03а 2.3 ± 0.1а 9.3 ± 0.8д
Большое Горецкое 5.3 11 0 .86 ± 0. 1 5 г 0.29 ± 0.01е 2.24 ± 0.04а 0.24 ± 0.02в 3.5 ± 0.1в 5.6 ± 0.2г
2 раза, активность сахаразы возрастает в 1.5— 5.4 раза, однако линейной зависимости не выявлено. Изменения значений V гидролиза крахмала (1.3—2.8 мкмоль/(г • мин)) и сахарозы (0.18—
0.89 мкмоль/(г • мин)) совпадают с изменениями активности соответствующих ферментов. У рыб с минимальным накоплением Н отмечены самые высокие значения Кт гидролиза углеводов. Увеличение содержания Н в мышцах сопровождается нелинейным снижением Кт гидролиза крахмала в 1.3—3.1 раза. Кт гидролиза сахарозы снижается в 2—10 раз, отражая увеличение фермент-субстра
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.