БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2014, том 31, № 3, с. 194-203
УДК 581.11.2:581.573.4
ВЛИЯНИЕ Са2+ И Н2О2 НА ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ cAMP В ВАКУОЛЯХ КЛЕТОК КОРНЕПЛОДОВ СТОЛОВОЙ СВЕКЛЫ ПРИ БИОТИЧЕСКОМ СТРЕССЕ
© 2014 г. Л. А. Ломоватская*, А. С. Романенко, О. В. Рыкун
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 317;
*электронная почта: LidaL@sifibr.irk.ru Поступила в редакцию 20.07.2013 г.
Запасание и утилизация веществ, исключенных из метаболизма, считается одной из основных функций вакуолей растительных клеток. Однако по некоторым данным эти органеллы содержат также компоненты некоторых сигнальных путей. Известно, что все сигнальные системы растений организованы в информационную сеть, участники которой подвергаются взаимовлиянию, благодаря чему от каждого вида внешнего раздражителя формируется уникальный внутриклеточный сигнал, позволяющий растительной клетке адекватно реагировать на раздражитель. В данной работе в вакуолях клеток корнеплодов столовой свеклы на разных стадиях покоя изучали влияние вторичных мессенджеров кальциевой и NADPH-оксидазной сигнальных систем: кальция и пероксида водорода, на концентрационную динамику cAMP — вторичного посредника аденилатциклазного сигнального каскада. cAMP найден в вакуолях двух типов: "солевых" и "сахарных". В неинфицирован-ных корнеплодах в период относительно высокой функциональной активности, в фазе начала покоя, большая часть cAMP выходит в инкубационную среду "солевых" и "сахарных" вакуолей. Напротив, в период глубокого покоя корнеплода максимальный уровень cAMP выявлен в вакуолях. Ионы кальция более существенно влияли на концентрационную динамику cAMP в "солевых" вакуолях, чем пероксид водорода, причем только в период начала покоя. При инфицировании корнеплодов патогенным грибом Botritis cinerea ионы кальция и пероксид водорода модулировали пул cAMP в "сахарных" вакуолях в этот же период покоя. Сделан вывод, что центральная вакуоль растительной клетки может участвовать в трансдукции и преобразовании внутриклеточных сигналов.
Ключевые слова: столовая свекла, "сахарные" вакуоли, "солевые" вакуоли, cAMP, кальций, пероксид водорода, начало покоя, глубокий покой, Botritys cinerea.
Б01: 10.7868/80233475514020042
Известно, что органеллы растительных клеток, обладающие собственным геномом, участвуют в обмене сигнальными молекулами и регуляции генной активности. Об этом можно судить по результатам изучения прямого и ретроградного внутриклеточных сигнальных каскадов [1, 2]. В то же время другие органеллы клеток растений с этой точки зрения практически не рассматриваются.
Традиционно считается, что одна из основных функций вакуолей растительных клеток — запасание и утилизация веществ, исключенных из метаболизма. Однако существуют данные как литературные, так и собственные, которые указывают на то, что вакуоли выполняют и сигнальные функции, поскольку они содержат компоненты нескольких сигнальных систем: кальциевой, аде-нилатциклазной, МАЭРН-оксидазной [3—5].
К настоящему времени установлено, что все сигнальные системы растений организованы в
информационную сеть, где их компоненты подвергаются взаимовлиянию, благодаря чему от внешнего раздражителя каждого вида формируется дифференцированный внутриклеточный сигнал, позволяющий растительной клетке адекватно на него реагировать [6]. При этом практически неизученным остается участие органелл клеток органов растений, находящихся на разных стадиях покоя, в трансдукции и модуляции внутриклеточных сигналов при биотическом стрессе. Актуальность проблемы связана с тем, что с углублением состояния покоя повышается степень устойчивости растительных клеток к фито-патогенам, а значит, происходят и качественные изменения в функционировании их сигнальных систем [7]. В этой связи важным представляется изучение участия вакуоли растительной клетки в трансдукции внутриклеточных сигналов, так как она, занимая до 90% пространства клетки, контактирует не только с другими органеллами [8],
но и с вновь образованными мембранными структурами, которые появляются, например, в процессе взаимодействия растения и гриба при формировании арбускулярной микоризы [9]. Это позволяет вакуолям достаточно эффективно участвовать в регуляции функционирования сигнальных систем.
Для зрелых корнеплодов столовой свеклы характерны чередующиеся слои клеток запасающей паренхимы в виде хорошо различимых радиальных колец на поперечном срезе корнеплода. В их состав входят зона проводящих пучков и зона межпучковой паренхимы. Ранее в СИФИБР СО РАН был разработан метод выделения интактных вакуолей из этих зон корнеплодов. Установлено, что клетки корнеплода содержат в основном две популяции вакуолей, каждая из которых приурочена к клеткам определенной зоны корнеплода. "Солевые" вакуоли, содержащие в основном ионы калия, натрия и кислые аминокислоты: глута-мин, аспарагин, глутаминовую и аспарагиновую кислоты, характерны для клеток межпучковой паренхимы. "Сахарные" вакуоли содержат сахарозу, раффинозу, глюкозу и фруктозу [10] и локализуются в клетках зоны проводящих пучков. Следует отметить, что физиологические процессы, протекающие в этих двух зонах на различных стадиях покоя корнеплода, неодинаковы. Так, в начале покоя и в период глубокого покоя вакуоли свеклы отличаются максимальным содержанием сахаров, отток которых резко возрастает при выходе из покоя и подготовке ко второму году вегетации (если он происходит). Напротив, содержание калия как в начале, так и на более продвинутой стадии покоя минимально, но возрастает также при активации ростовых процессов, к началу второго года вегетации [10].
Исходя из этого, целью данной работы было изучение влияния кальция и пероксида водорода на концентрационную динамику сАМР — вторичного посредника аденилатциклазной сигнальной системы вакуолей клеток корнеплодов столовой свеклы на различных стадиях покоя, в том числе на фоне биотического стресса.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительным материалом служили корнеплоды столовой свеклы (Beta vulgaris L.) сорта Бордо на стадиях начала и глубокого покоя, которые хранили при температуре +4°С.
Биотический стресс создавали, заражая здоровые корнеплоды мицелием фитопатогенного гриба Botritys cinerea, который входит в состав кагат-ной (серой) гнили. Корнеплод инфицировали следующим образом: на верхнюю его часть в месте выхода листьев наносили мицелий гриба. По-
195
сле этого корнеплоды выдерживали в темноте 14 дней при температуре +4°С.
Проникновение гифов гриба в клетки паренхимы отслеживали на срезах тканей корнеплода с помощью светового микроскопа. При выделении вакуолей из инфицированных корнеплодов не-кротизированную паренхиму удаляли и использовали соседние живые ткани, не содержащие гифов гриба.
Выделение вакуолей. Вакуоли выделяли модифицированным макрообъемным методом, разработанным в лаборатории физиологии растительной клетки СИФИБР СО РАН [10]. Получали две фракции вакуолей — сахарные и солевые, различающиеся качественным составом внутренней среды, а также плавучей плотностью [10].
Определение уровня cAMP в вакуолях и среде их инкубации. К суспензии вакуолей, находящейся в среде ресуспендирования, содержащей 6.5 мМ трис-HCl (pH 7.4), 1 М KCl, 1 мМ MgCl2, 0.1 мМ теофиллин (ингибитор фосфодиэстеразы cAMP), добавляли растворы СаС12 или Н2О2, приготовленные на основе той же среды. Контролем служила фракция вакуолей без пероксида водорода и ионов кальция. Конечные концентрации Н2О2 составляли 100 нМ, 500 нМ, 1 мкМ, 10 мкМ; СаС12 - 100 нМ, 350 нМ, 700 нМ, 7 мкМ. Суспензию вакуолей инкубировали с СаС12 или Н2О2 в течение 20 с, после чего центрифугировали при 14000 g в течение 40 с. В полученном супернатан-те (среда инкубации вакуолей) определяли уровень cAMP, а осадок вакуолей трижды промывали в среде следующего состава: 6.5 мМ трис-HCl (pH 7.4), 1 М KCl, 1 мМ MgCl2, 0.1 мМ теофил-лин, после чего осадок помещали в гипотоническую среду (1 мМ трис-HCl, рН 7.4, 1 мМ MgCl2, 0.1 мМ теофиллин и 0.1 мМ 2-меркаптоэтанол) в соотношении 1 : 2 (вакуоли : среда) для высвобождения вакуолярного сока. После этого образцы кипятили на водяной бане (3 мин) для инактивации ферментов и разрушения тонопласта, измеряли в них уровень cAMP. Концентрацию cAMP во всех образцах определяли с помощью ИФА с применением первичных поликлональ-ных антител против cAMP и вторичных поликло-нальных антител, меченных пероксидазой [11].
Проверка стабильности вакуолей при воздействии ионов кальция и пероксида водорода. Стабильность вакуолей проверяли, измеряя концентрацию бетациа-нинов в среде инкубации вакуолей, на спектрофотометре Specord S-100 (Германия) при X = 540 нм и вычисляли по формуле:
П; = A540V/E, где П; — содержание бетациани-нов в образце (мкМ), A540 — оптическая плотность при длине волны 540 нм, V — объем образца, мл, Е — молярный коэффициент поглощения (62 М-1 см-1 ) [12].
Определение H2O2 в вакуолях и среде их инкубации.
Количество пероксида водорода в вакуолях определяли при помощи FOX-метода, основанного на изменении окраски ксиленолового оранжевого [13]. С этой целью использовали реактив, состоящий из двух растворов. Раствор 1 — 25 мМ FeSO4, 25 мМ (NH4)2SO4, 2.5 М H2SO4; и раствор 2, который включал 125 мкМ ксиленолового оранжевого и 100 мМ сорбита. Растворы 1 и 2 смешивали непосредственно перед работой в соотношении 1 : 100. Затем к суспензии вакуолей добавляли полученную смесь в соотношении 1 : 10, и инкубировали в течение 30 мин в темноте, после чего измеряли концентрацию пероксида водорода на планшетном спектрофотометре M680 (Bio-Rad, Германия) при длине волны 595 нм.
Определение общего кальция. Содержание общего кальция определяли на атомно-абсорбци-онном спектрометре (модель 403 фирмы Perkin Elmer, США) в пламени ацетилен—воздух. Для градуировки прибора использовали стандартные образцы с разными концентрациями ионов кальция. Растительные пробы разбавляли в 10 раз. Для устранения влияния матрицы пробы к стандартным образцам и анализируемым пробам добавляли буферный раствор хлорида лантана в концентрации 50 мг/мл из расчета 0.25 мл на 4 мл анализируем
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.