научная статья по теме ВЛИЯНИЕ САЛИЦИЛОВОЙ И ЖАСМОНОВОЙ КИСЛОТ НА АКТИВНОСТЬ И СПЕКТР ЗАЩИТНЫХ БЕЛКОВ ПШЕНИЦЫ ПРИ ЗАРАЖЕНИИ ВОЗБУДИТЕЛЕМ СЕПТОРИОЗА Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ САЛИЦИЛОВОЙ И ЖАСМОНОВОЙ КИСЛОТ НА АКТИВНОСТЬ И СПЕКТР ЗАЩИТНЫХ БЕЛКОВ ПШЕНИЦЫ ПРИ ЗАРАЖЕНИИ ВОЗБУДИТЕЛЕМ СЕПТОРИОЗА»

ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2015, № 1, с. 34-41

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ =

УДК 571.27:632.4:632.938:633.11

ВЛИЯНИЕ САЛИЦИЛОВОЙ И ЖАСМОНОВОЙ КИСЛОТ НА АКТИВНОСТЬ И СПЕКТР ЗАЩИТНЫХ БЕЛКОВ ПШЕНИЦЫ ПРИ ЗАРАЖЕНИИ ВОЗБУДИТЕЛЕМ СЕПТОРИОЗА

© 2015 г. Л. Г. Яруллина*, **, Р. И. Касимова*, Г. Ф. Бурханова*, А. Р. Ахатова*

*Институт биохимии и генетики УНЦРАН,

450054 Уфа, просп. Октября, 71 **Башкирский государственный университет, 450074 Уфа, ул. З. Валиди, 32 E-mail: yarullina@bk.ru Поступила в редакцию 13.01.2014 г.

Исследовано влияние медиаторов сигнальных систем салициловой (СК) и жасмоновой (ЖК) кислот на генерацию Н2О2 и экспрессию генов защитных белков в листьях пшеницы Triticum aestivum L. при инфицировании возбудителем септориоза Septoria nodorum Berk. Установлено, что предпосевная обработка семян СК и ЖК снижала степень развития гриба на листьях пшеницы и оказывала стимулирующее действие на продукцию Н2О2 в зоне инфицирования. Методoм полимеразной цепной реакции показано усиление в инфицированных тканях экспрессии генов оксалатоксидазы AJ556991.1 и анионной пероксидазы TC 151917.

DOI: 10.7868/S0002332914050130

Устойчивость растений к воздействию абиотических и биотических факторов среды, в том числе к поражению патогенами, обеспечивается реализацией целого комплекса физиолого-биохими-ческих процессов, протекающих на клеточном, тканевом и организменном уровнях. Так, при контакте с патогенами в растениях образуются сигнальные молекулы, индуцирующие или стимулирующие ответные защитные реакции (Huckelhoven, Kogel, 2003). Активные формы кислорода (АФК), в том числе перекись водорода (Н2О2), принимают непосредственное участие в формировании и реализации ответных защитных реакций растения при инфицировании патогенами (Galvez-Valdivieso, Mullineaux, 2010). В растительном организме Н2О2 выполняет несколько функций. Во-первых, она как сигнальная молекула активирует транскрипционные процессы в клетках растений (Jaspers, Kangasjärvi, 2010). Так, под воздействием Н2О2 происходит активация экспрессии генов патогениндуцируемых защитных белков (PR-белки) при реализации локального и системного иммунитета (Тарчевский и др., 2010). Во-вторых, в высоких концентрациях Н2О2 оказывает биоцидное действие на патогены. В регуляции концентрации Н2О2 в растительных тканях большую роль играют оксидоредуктазы, в том числе оксалатоксидазы (Dumas et al., 1995) и пероксидазы (Bestwick et al., 1997). Эндогенная пе-роксидаза растений с использованием Н2О2 способна окислять фенольные соединения, что на-

прямую связано с укреплением клеточных стенок за счет лигнификации.

Сигнальными молекулами, механизм защитного действия которых связан с индукцией генерации АФК в растительных тканях, являются салициловая (СК) и жасмоновая (ЖК) кислоты (Wang, Li, 2006; Ладыженская, Кораблева, 2008). Предполагается, что сигнальные молекулы СК и ЖК влияют на устойчивость к биотрофам и определяют развитие устойчивости к некротрофам соответственно (Stout et al., 1999; Straus et al., 2010). Однако в инфицированных растениях араби-допсиса при совместном использовании определенных концентраций СК и ЖК наблюдается взаимное подавление (интерференция) физиологической активности указанных медиаторов и формирование восприимчивости к соответствующим патогенам (Stout et al., 1999) и, напротив, в других концентрациях проявляется синергизм (Mur et al., 2006). Одним из механизмов интерференции между сигнальными молекулами может быть ингибирование высокими концентрациями, например, СК синтеза предшественников ЖК (Peña-Cortés et al., 1993). В то же время в мутант-ных растениях арабидопсиса, дефицитных по СК, содержание ЖК не увеличивалось (Takahashi et al., 2004). Следовательно, СК не лимитировала накопление ЖК. Таким образом, в литературе нет однозначного ответа на вопрос о механизмах формирования защитного ответа под воздействием СК и ЖК.

ВЛИЯИИЕ САЛИЦИЛОВОЙ И ЖACMОНОBОЙ KИCЛОТ

35

Как известно, стратегия защитного ответа растительного организма во многом определяется типом пищевой специализации грибов. Длительный процесс коэволюции растений и микроорганизмов привел к появлению различных форм паразитизма патогенов: от эволюционно раннего факультативного паразитизма (некротрофность) до высокоспециализированного облигатного (биотрофность). Однако в природе широко представлены патогены с промежуточным (гемибио-трофным) типом питания. Типичным гемибио-трофом является возбудитель септориоза пшеницы — гриб Septoria nodorum Berk. (Морозов, 1992). Свое развитие в тканях растения-хозяина он начинает как биотрофный фитопатоген, стимулируя обмен растения-хозяина веществами гормональной природы (Волынец, Афанасьева, 1990), затем выделяет токсины, губительные для растения, что свидетельствует о его некротрофных свойствах (Parbery, 1996). Этот патоген поражает проростки и взрослые растения пшеницы. Визуально поражения проявляются в виде коричневых или бурых мелких пятен на поверхности растений (Пыжикова, 1984). Такую систему рас-тение—гемибиотрофный патоген можно использовать для изучения влияния СК и ЖК на экс-прессионную активность генов оксалатоксидазы и пероксидазы как регуляторов содержания Н2О2, а также изменений в спектре защитных белков под воздействием их обработки.

Цель работы — изучение влияния СК и ЖК на развитие S. nodorum на листьях пшеницы, генерацию в них Н2О2 и изменение экспрессионной активности генов защитных белков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследования были выбраны растения пшеницы Triticum aestivum L сорта Башкирская-24. Перед посадкой семена замачивали в растворах 10-5 М СК или 10-7 М ЖК, контрольные растения замачивали в дистиллированной воде. Семена проращивали на фильтровальной бумаге при комнатной температуре. Полностью развернутые листья семисуточных проростков срезали, помещали во влажную камеру на фильтровальную бумагу, срезы прикрывали ватой, смоченной в растворе бензимидазола (40 мг/л) (Пыжикова, Ка-расева, 1986). Срезанные листья инокулировали суспензией пикноспор возбудителя септориоза S. nodorum Berk. (106 спор/мл), которые были выделены из местной популяции гриба. Инокулиро-ванные листья выдерживали при комнатной температуре в темноте в течение 24 ч, после чего переносили на светоплощадку с фотопериодом 16 ч/сут и освещенностью 12—16 тыс. лк. Интенсивность развития гриба оценивали в течение 3

сут после инокуляции. В качестве контроля использовали неинфицированные листья растений.

Для выявления продукции И2О2 в зоне роста грибов срезанные листья инфильтрировали раствором 3,3-диаминобензидина с добавлением щавелевой кислоты в течение 30 мин (Caliskan, Cuming, 1998), затем фиксировали в 96%-ном этиловом спирте. Исследования проводили на микроскопе Imager M1 (Carl Zeiss, Германия).

РНK из растений выделяли фенольно-детер-гентным методом. Для получения кДНK на основе мРНK изучаемых образцов проводили полимераз-ную цепную реакцию (ПЦР) с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) согласно протоколу фирмы-поставщика с использованием обратной тран-скриптазы M-MuLV (Fermentas, США). ОТ-ПЦР проводили в амплификаторе типа ТП4-ПЦР-01-"Терцик" (ДНK-технология, Россия). После амплификации фрагменты ДНK фракционировали методом электрофореза в 1—2%-ном агарозном геле или 7%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в электрофоретической камере S2 (Хеликон, Россия). В качестве положительного контроля использовали ПЦР гена, кодирующего конститутивно экспрессирующийся тубулин. С помощью программы Primer Select (DNAStar, США) были подобраны высокоспецифичные праймеры к гену оксалатоксидазы (AJ556991.1) и анионной пероксидазы (TC 151917), фланкирующие фрагменты ДНK размером 410 и 157 пар нуклеотидов соответственно. Экспериментальным путем были подобраны условия проведения ПЦР. ^мпью-терный анализ аминокислотных и нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene (DNAStar Inc, США).

Растворимые белки выделяли путем растирания листьев в жидком азоте с использованием сахарозного буфера и фенола в соответствии с рекомендациями Винсента с соавт. (Vincent et al, 2006). Пробы центрифугировали 30 мин при 4400 об./мин. Затем к супернатанту, содержащему растворимые белки, добавляли ледяной раствор ацетата аммония в спирте в соотношении 1 : 4. Белки выдерживали 1 ч при —20°С. Осажденный белок промывали 3 раза охлажденным спиртом и хранили при —70°С. Белок растворяли в буфере, содержавшем 8 M мочевину, 2 M тиомочевину, 1%-ный 3-[(3-хо-ламидопропил)диметиламмонио]-1-пропансуль-фонат, 30 мM дитиотреитол, 20 мM Tris-основной, 0.3%-ный раствор амфолитов, pH 3—10.

^личество белка определяли колориметрическим методом Брэдфорд. ^н^трацию белка определяли по калибровочному графику. Для построения калибровочной кривой использовали растворы бычьего сывороточного альбумина (1— 0.1 мг/мл).

Рис. 1. Влияние салициловой (СК) и жасмоновой (ЖК) кислот на развитие возбудителя септориоза в листьях пшеницы. а — интенсивность прорастания спор через 24 ч после инфицирования. Масштаб: 50 мкм. б — генерация H202 в клетках мезофилла в зоне инфицирования через 48 ч после инфицирования. Масштаб: 100 мкм. 1 — контроль, 2 — обработка СК, 3 — обработка ЖК.

Изоэлектрофокусирование белков проводили на приборе Protean IEF (BioRad, США). Для разделения белков в первом направлении (по изо-электрической точке) использовали готовые семисантиметровые стрипы (BioRad) с рН 3—10. Перед фокусированием проводили пассивную регидратацию в течение 12 ч при 20°С. Фокусирование проводили при напряжении 4000 В (20000 В/ч) в течение 22 ч, затем поддерживали напряжение 500 В до окончания процесса. После изоэлектрофокусирования стрипы выдерживали по 15 мин последовательно в растворах 2%-ного дитиотреитола и 2.5%-ного йодацетамида в буферных растворах с 25%-ным глицерином, затем промывали в 0.025 М Tris-глициновом буфере, рН 8.3.

Для разделения белков по молекулярной массе проводили DsNa-электрофорез в 10%-ном ПААГ методом Лэммли (концентрация ПААГ в концентрирующем геле — 4%). Стрип и маркерные белки на фильтровальной бумаге помещали на ПААГ и заливали 1%-ной агарозой на Tris-глиц

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»