ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 5, с. 579-583
УДК 577.15:633.11
ВЛИЯНИЕ САЛИЦИЛОВОЙ кислоты НА АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ У ПШЕНИЦЫ В УСЛОВИЯХ ЗАСОЛЕНИЯ
© 2004 г. А. Р. Сахабутдинова, Д. Р. Фатхутдинова, Ф. М. Шакирова
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, г. Уфа, 450054;
e-mail: shakirova@anrb.ru Поступила в редакцию 11.06.2003 г.
Исследовано влияние предобработки 0.05 мМ салициловой кислотой (СК) на активность суперок-сиддисмутазы (СОД) и пероксидазы в корнях 4 сут проростков пшеницы (Triticum aestivum L.) в условиях засоления. Показано, что предобработанные СК проростки характеризовались значительно меньшим уровнем стресс-индуцированного накопления активных форм кислорода и соответственно активности СОД и пероксидазы по сравнению с необработанными, что указывает на вовлечение этих ферментов в спектр защитного действия СК на растения при засолении.
Эндогенный регулятор роста - салициловая кислота (СК) выполняет в растениях разнообразные физиологические функции [1]. Однако особое внимание к СК связано с выявлением ее ключевой роли в индукции системной приобретенной устойчивости [2]. Вместе с тем, к настоящему времени накопилось немало сведений, убедительно указывающих на участие СК в повышении устойчивости растений к стрессовым факторам абиотической природы, таким как засоление [3], дефицит влаги [4], гипо- и гипертермия [5, 6], воздействие тяжелых металлов [7]. Совокупность этих данных позволяет рассматривать СК в качестве индуктора неспецифической устойчивости растений [8], что, вероятно, обусловлено ее влиянием на накопление абсцизовой кислоты (АБК) [9], которая играет важную роль в запуске защитных реакций к стрессовым факторам не только абиотической, но и биотической природы [10, 11].
Известно, что стрессовые факторы смещают прооксидантно-антиоксидантное равновесие в клетках растений, что связано с усилением продукции активных форм кислорода (АФК), вызывающих активацию перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембранных структур клеток [12, 13]. Важная роль в нейтрализации последствий окислительного стресса принадлежит антиоксидантной системе. В литературе имеются данные, свидетельствующие о влиянии СК на генерацию 02 и Н2О2 [14, 15], а также активность супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.1), пероксидазы (КФ 1.11.1.7) и каталазы (КФ 1.11.1.6), задействованных в утилизации этих АФК [5, 6, 16]. Однако сведениями о ее эффекте на уровень АФК, с одной стороны, и активность системы детоксикации АФК, с другой стороны, в растениях пшеницы, подвергнутых воздействию стрессо-
вых факторов, к моменту начала нашей работы мы не располагали. Вместе с тем эти знания важны для понимания механизмов, лежащих в основе реализации антистрессового действия СК на растения, что необходимо для обоснования практического применения этого природного регулятора роста для повышения устойчивости пшеницы к неблагоприятным факторам среды.
Цель работы - изучение влияния предобработки СК на антиоксидантную систему проростков пшеницы и выяснение ее роли в проявлении защитного действия СК на растения в условиях засоления среды.
МЕТОДИКА
Исследования проводили на корнях 4 сут проростков пшеницы ТгШеит aestivum Ь. сорта Саратовская 29. Семена после стерилизации 96%-ным этанолом проращивали в кюветах на фильтровальной бумаге в течение 3 сут (16-часовой фотопериод, 15 клк, 22-24°С). После отделения эндосперма проростки инкубировали в течение 24 ч на растворе 2%-ной сахарозы, содержащей 0.05 мМ СК. Именно эта концентрация СК, как нами показано ранее, эффективна при стимуляции роста проростков пшеницы и повышении их устойчивости к стрессовым факторам среды [4]. Через 4 сут проростки переносили на смесь 2%-ной сахарозы и 2%-ного КаС1. Контролем во всех опытах служили проростки, инкубированные на растворе 2%-ной сахарозы.
Об интенсивности перекисного окисления липидов судили по концентрации 02, Н2О2 и конечного продукта ПОЛ - малонового диальдегида [7, 15, 17].
579
6*
мкмоль 100
80
60 40 20 0
□ I
□ II
□ III и IV
1
(а)
ш
ж
% от контроля 180
1
3
160 140 120 100
(б)
II
III
IV
Рис. 1. Влияние предобработки 0.05 мМ СК на генерацию О2 (а) и Н2О2 (б) в среде инкубации 4 сут проростков пшеницы, подвергнутых воздействию №С1: I - контроль, II - 2%-ный №С1, III - СК, IV - СК + 2%-ный N0!.
Для определения концентрации ü2 проростки выращивали на растворе 0.25 мМ CaCl2 в течение 3 сут, а затем проводили последовательную обработку СК и хлоридом натрия, как указано выше.
Генерацию O- определяли акцепторным методом по превращению адреналина в адренохром. Для этого контрольные и опытные образцы, каждый из которых состоял из 10 проростков, инкубировали на растворе 0.025 мМ CaCl2 при 30° в течение 1 ч, после чего вносили 1 мл 10-3 М адреналина и через 15 мин реакцию превращения адреналина в адренохром в среде инкубирования проростков останавливали 0.05 н. HCl. Оптическую плотность растворов измеряли при 490 нм [15].
Концентрацию перекиси водорода оценивали по окислению ортофенилендиамина (ОФД), инициированного щавелевой кислотой, в результате окислительного распада которой с участием растительной оксалатоксидазы образуется Н2О2 [17]. Для этого по 10 проростков пшеницы инкубировали в чашках Петри на растворе 0.01 М KCl, содержащем 0.05%-ный ОФД. Затем после добавления 0.025 М щавелевой кислоты и осторожного перемешивания отбирали аликвоты среды с интервалом 2 мин, вносили их в лунки полистиролового планшета для иммуноанализа ("Linbro", Великобритания), куда предварительно добавляли 0.05 мл 4 М H2SO4. Поглощение образцов измеряли при 492 нм на фотометре ("Titertek Uniskan", Великобритания). Активность окисления ОФД выражали в единицах поглощения на 1 г сырой массы корней [17].
Активность СОД определяли с использованием нитросинего тетразолия [18]. Для определения активности пероксидазы в качестве субстрата использовали гваякол; активность фермента выражали в условных единицах (усл. ед.) на 1 мг белка, что соответствует 1 мкмолю окисленного гваякола в 1 мин на 1 мг белка при оптимальных услови-
ях [19]. Содержание белка определяли по методу Бредфорд.
О проницаемости клеточных мембран проростков судили по выходу электролитов [20], который регистрировали с использованием кондуктометра ОК 102/1 ("КаёеШв", Венгрия), измеряя омическое сопротивление водных экстрактов в постоянном токе [21].
На рисунках представлены данные средних арифметических двух - трех опытов, каждый их которых проведен в трех биологических повтор-ностях, и стандартные ошибки средних.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Стрессовые воздействия разной природы, как известно, вызывают генерацию АФК в клетках. Поэтому неудивительно, что инкубирование 4 сут проростков на среде, содержащей 2%-ный КаС1, приводило уже через 1 ч к двукратному, а к концу опыта - почти трехкратному увеличению концентрации О2 в корнях проростков (рис. 1а). Засоление также индуцировало образование в проростках и Н2О2 (рис. 16), что вполне согласуется с данными об усилении генерации АФК в растениях при засолении [22]. Предобработанные СК проростки, подвергнутые воздействию 2%-ного КаС1, отличались существенно меньшим содержанием О2 и Н2О2 в сравнении с необработанными (рис. 1). Сама по себе предобработка СК вызывала небольшое увеличение концентрации О2 и Н2О2 в среде инкубации корней проростков, что согласуется с имеющимися в литературе данными о способности СК индуцировать усиление генерации О2 и Н2О2 [14, 15]. Полученные нами результаты, по-видимому, свидетельствуют о восприятии растениями СК как некоего химического агента, вызывающего первоначальные внутриклеточные изменения
мкмоль/мг белка мин 10
1
(а)
I
I
усл. ед./мг белка 120 100 80 60 40 20 0
ч
(б)
1
1
1
1
Рис. 2. Динамика активности СОД (а) и пероксидазы (б) в корнях предобработанных и не обработанных 0.05 мМ СК 4 сут проростков пшеницы при засолении. Обозначения см. на рис. 1.
1
2
3
антиоксидантной системы, не приводящих, однако, к повреждению проростков, судя по ярко выраженному ростстимулирующему эффекту предобработки CK на растения пшеницы [9]. Напротив, небольшой уровень продукции АФК может иметь важное значение для предадаптирующего действия CK на проростки к последующим стрессовым ситуациям, поскольку известно, что АФК выступают в качестве сигнальных молекул в запуске каскада защитных реакций в растениях [12, 13]. Однако резкое стресс-индуцированное возрастание концентрации АФК может приводить к серьезным деструктивным последствиям, что требует их нейтрализации антиоксидантными ферментами. Поэтому далее нами был проведен анализ активности СОД, катализирующий реакцию дисмута-
ции O- в Н2О2, и пероксидазы в корнях обработанных и необработанных CK проростков в норме и при засолении.
Как видно из рис. 2, засоление вызывает значительное возрастание активности СОД и пероксидазы в корнях проростков. 2%-ный NaCl вызывал почти двукратное повышение активности СОД в растениях на протяжении всего опыта (рис. 2а), что, по-видимому, связано с существенным усилением генерации O-. В предобработанных CK проростках при воздействии 2%-ного NaCl также наблюдалось повышение активности СОД, однако заметно в меньшей степени в сравнении с необработанными, что, вероятно, обусловлено меньшим уровнем продукции O2 в них. Предобработка CK в нормальных условиях также способствовала активации CОД в растениях пшеницы относительно контроля (рис. 2а), что согласуется с данными, полученными, например, на растениях кукурузы (Zea mays L.), огурца (Cucumis sativus L.) и риса (Oriza sativa L.), которые демонстрируют увеличение активности CОД и, как следствие, развитие их устойчивости к последующему воздействию гипотермии под влиянием CK [16]. Активация общеклеточной CОД может быть связана как с изме-
нением активности ее латентных изоформ, так и новообразованием этого фермента. Ранее нами было выявлено, что обработка СК приводит к обратимому накоплению в растениях пшеницы АБК [9], участвующей, как известно, в индукции экспрессии генов белков, задействованных в стрессовом ответе растений [11], в том числе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.