научная статья по теме ВЛИЯНИЕ СЕЛЕКТИВНОГО ИНГИБИТОРА ЦИКЛИН В-ЗАВИСИМОЙ КИНАЗЫ CDK1 РОСКОВИТИНА НА СБОРКУ ЯДРЫШКА В МИТОЗЕ Химия

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ СЕЛЕКТИВНОГО ИНГИБИТОРА ЦИКЛИН В-ЗАВИСИМОЙ КИНАЗЫ CDK1 РОСКОВИТИНА НА СБОРКУ ЯДРЫШКА В МИТОЗЕ»

БИОХИМИЯ, 2008, том 73, вып. 4, с. 504 - 514

УДК 577.112.855

ВЛИЯНИЕ СЕЛЕКТИВНОГО ИНГИБИТОРА ЦИКЛИН В-ЗАВИСИМОЙ КИНАЗЫ CDK1 РОСКОВИТИНА НА СБОРКУ ЯДРЫШКА В МИТОЗЕ*

© 2008 г. О.О. Жарская1, А.С. Барсукова2, О.В. Зацепина12**

1 НИИ биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10;

факс: (495)330-6647, электронная почта: zatsepina_olga@mail.ru

2 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ

им. М.В. Ломоносова, 119992 Москва; факс: (495)939-0338

Поступила в редакцию 02.08.2007 После доработки 30.10.07

Известно, что при вступлении клеток в митоз ядрышко распадается, а затем вновь собирается на завершающих стадиях клеточного деления. Однако механизмы регуляции этих процессов до сих пор остаются невыясненными. Впервые показано, что селективное ингибирование циклин В-зависимой киназы СБК1 рос-ковитином индуцирует начало сборки ядрышка преждевременно — в метафазе митоза. Обнаружено, что под воздействием росковитина в цитоплазме метафазных клеток формируются структуры, содержащие основные белки материнского ядрышка, которые участвуют в процессинге рРНК — В23/нуклеофозмин, С23/нук-леолин, Мор52, фибрилларин, а также незрелую 46—458 пре-рРНК. Этот эффект воспроизводится на разных клеточных культурах, что указывает на универсальность механизмов регуляции начальных стадий сборки ядрышка у млекопитающих. На основании полученных и литературных данных высказано предположение, что инактивация комплекса СБК1-циклин В, имеющая место в конце нормального митоза, приводит к дефосфорилированию белков В23/нуклеофозмин и С23/нуклеолин, что способствует их взаимодействию с пре-рРНК и приводит к формированию нерастворимых супрамолекулярных комплексов — цитоплазма-тических производных ядрышка.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ядрышко, митоз, циклин В-зависимая киназа СБК1, цитоплазматические ядрыш-ковые дериваты (ЦЯД), фибрилларин, В23/нуклеофозмин, росковитин.

Ядрышко — эволюционно-консервативный и наиболее крупный (1—5 мкм) структурный домен клеточного ядра, основной функцией которого является синтез рибосом [1—3]. В клетках высших эукариот ядрышко сохраняет структурную целостность и функциональную активность, преимущественно на стадии интерфазы.

Принятые сокращения: 5'ВшТС — 5'-внешний транскрибируемый спейсер, ДАФИ — 4',6-диамидино-2-фени-линдол, иЦЯД — индуцированные цитоплазматические ядрышковые дериваты, пре-рРНК — 47-45S предшественник рибосомной РНК, рДНК — рибосомная ДНК, рРНК — рибосомная РНК, ФИТЦ — флуоресцеинизотиоцианат, ФСБ — фосфатный солевой буфер, ЦЯД — цитоплазматические ядрышковые дериваты, ЯОР — ядрышкообразую-щие районы хромосом, CDK1 (cyclin-dependent kinase 1) — циклинзависимая киназа 1, FISH (fluorescent in situ hybridization) — флуоресцентная гибридизация in situ, SSC — standard saline citrate, UBF — upstream binding factor.

* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 07-268, 24.02.08.

** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.

При вступлении клеток в митоз, одновременно с конденсацией хроматина в хромосомы и подавлением транскрипции рибосомных генов (рДНК) ядрышко распадается [4—8]. К пусковым механизмам, запускающим распад ядрышка, относят, в первую очередь, фосфорилирова-ние белков, участвующих в транскрипции рДНК [9—11] и процессинге рРНК [12—17], таких как UBF (upstream binding factor, специфический кофактор РНК полимеразы I), В23/нуклеофозмин (основной фактор сборки пре-рибосом) и С23/нуклеолин (участвует в разных стадиях созревания рРНК) [1, 2]. Ключевую роль в фосфо-рилировании этих белков играет основная мито-тическая киназа CDK1 (р34с4:2), активность которой проявляется в комплексе с циклином В [18—20]. Изменение в уровне фосфорилирова-ния белков В23 и С23 приводит к замедлению их электрофоретической подвижности [13], ослаблению связи с рРНК и выходу из ядрышка [16]. К центральной стадии митоза — метафазе — ядрышко полностью распадается, а основная мас-

са его материала распределяется по цитоплазме. Исключением являются лишь компоненты транскрипционного комплекса РНК-полимера-зы I, которые на протяжении всего митоза сохраняют прочную связь с рДНК в составе ядрышко-образующих районов хромосом (ЯОР) [5, 9, 11].

Согласно последним литературным данным, восстановление ядрышка начинается вскоре после расхождения хромосом к полюсам мито-тического веретена, т.е. в анафазе или ранней телофазе. Начальные стадии реформирования ядрышка проявляются в виде двух событий: реактивации транскрипции рДНК [4, 5, 21] и появления в цитоплазме клеток многочисленных дискретных структур, которые получили название цитоплазматических производных ядрышка (или цитоплазматических ядрышковых дериватов, ЦЯД) [3, 4, 6—8]. Впервые термин «цитоп-лазматические ядрышковые дериваты» (nucleo-lus-derived foci, NDF) был предложен для описания телец, возникающих в телофазных клетках мартышки линии СМТ3, стабильно трансфици-рованных плазмидой, экспрессирующей белок Rev вируса СПИДа [22]. Позднее ЦЯД были описаны в других типах клеток животных, а также у растений, что подчеркивает универсальность этих образований [23—26]. С помощью иммуноцитохимических подходов и специфических антител установлено, что основными молекулярными компонентами ЦЯД являются белки, участвующие в процессинге рРНК : фиб-рилларин (фактор раннего процессинга пре-рРНК), Nop52 (участвует в поздних стадиях сборки рибосом), а также фосфопротеины В23 и С23, основные функции которых описаны выше [2, 27, 28]. Методом флуоресцентной гибридизации in situ в ЦЯД выявлены также разные типы рРНК, включая зрелую 18S и 28S рРНК и частично процессированную 46—45S пре-рРНК [4, 8, 23, 29, 30]. Характерно, что в ЦЯД отсутствуют рДНК и связанные с рибосомными генами белки, включая РНК полимеразу I и белок UBF [24, 26]. Есть основания полагать, что основными функциями ЦЯД является участие в сборке дочерних ядрышек и в процессинге незрелых рРНК материнского ядрышка, которые были синтезированы в интерфазе, предшествующей митозу. В пользу первого предположения говорят прямые наблюдения о миграции материала ЦЯД в ядра дочерних клеток [29], в пользу второй — наличие в составе ЦЯД всех основных белковых компонентов, принимающих участие в созревании рРНК в интерфазных ядрышках, а также незрелой пре-рРНК.

Несмотря на то что события, сопровождающие формирование ядрышка, достаточно подробно описаны на клеточном уровне, молеку-

лярные основы этого процесса изучены плохо. В первую очередь это связано с отсутствием надежных подходов для синхронизации клеток на поздних стадиях митоза, а также с невозможностью моделирования сборки функционально-активного ядрышка в системе in vitro. Поэтому особый интерес представляет разработка подходов, позволяющих направленно индуцировать формирование ядрышка или воспроизводить отдельные стадии этого процесса на клеточном уровне под воздействием факторов, влияющих на нормальное течение митоза. К таким факторам относится противоопухолевый агент роско-витин, избирательно подавляющий активность CDK1 путем взаимодействия с ее АТР-связыва-ющими участками [31—35]. Известно, что по мере завершения нормального митоза CDK1 инак-тивируется за счет распада комплекса CDK1— циклин В, чему в решающей степени способствует деградация циклина В [36]. В соответствии с этими данными, показано, что длительная (3 ч) обработка росковитином клеток в интерфазе приводит к резким структурным перестройкам ядрышка, а короткое (15—90 мин) воздействие в митозе индуцирует преждевременную активацию ЯОР хромосом [37, 38]. В настоящей работе мы впервые показали, что ингиби-рование CDK1 индуцирует также преждевременную сборку цитоплазматических производных ядрышка, что сопровождается изменением электрофоретической подвижности белков В23/ нуклеофозмина и С23/нуклеолина, свидетельствующем о дефосфорилировании белков. Принимая во внимание литературные данные о состоянии B23 и С23 в митозе, мы высказали предположение, что дефосфорилирование В23 и С23 индуцирует их связь с пре-рРНК и, тем самым, способствует формированию нерастворимых крупных макромолекулярных комплексов — ци-топлазматических дериватов ядрышек. Полученные данные позволяют рассматривать возможность формирования ЦЯД в метафазе митоза при подавлении активности CDK1 в качестве нового экспериментального подхода для оценки эффективности ингибиторов этой киназы, которые могут найти применение в химиотерапии опухолей.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клетки. Использовали культуры клеточных линий человека He La, свиньи СПЭВ, мыши NIH/3T3 и зеленой мартышки CV1. Культуры клеток HeLa, СПЭВ и NIH/3T3 выращивали в среде ДМЕМ («ПанЭко», Россия) с добавлением 5-8%-ной эмбриональной сыворотки телен-

ка («HyClone», США), L-глутамина и антибиотиков пенициллина и стрептомицина в стандартных концентрациях. Культуру клеток CV1 выращивали в смеси сред ДMЕM и F12 (1 : 1) («Пан-Эко») с добавлением Ю%-ной эмбриональной сыворотки теленка, L-глутамина и антибиотиков в стандартных концентрациях. Клетки выращивали при температуре 37° в инкубаторе с 5%-ным содержанием СО2 и во влажной атмосфере («Sanyo», Япония).

Антитела. В работе использовали следующие антитела: кроличьи поликлональные антитела к белку UBF («Santa Cruz», США); аутоиммунные сыворотки к белку фибрилларину [39, 4G] и белку Nop52 [26, 28]; мышиные моноклональные антитела к С23/нуклеолину [24, 26]; мышиные моноклональные антитела к В23/нуклеофозми-ну («Sigma», США). В качестве вторичных антител использовали антитела к иммуноглобулинам мыши, человека и кролика, конъюгированные с ФИТЦ (флуоресцеинизотиоцианат, «Sigma»), Alexa-688 («Molecular Probes», США) или техасским красным («JacksonImmunoResearch Lab», США).

Специальные обработки клеток. Клетки, растущие на покровных стеклах или в культураль-ных флаконах, инкубировали с росковитином (2-(1-ethyl-2-hydroxyethylamino)-6-benzylamino-9-isopropylpurine, «Sigma») в концентрации 75—15G мкM в течение 1G—6G мин при температуре 37°. В параллельных экспериментах клетки обрабатывали ингибитором фосфатаз РР1 и РР2А окадаево

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком