БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2012, том 29, № 5, с. 324-328
УДК 612.816.7
ВЛИЯНИЕ СЕРОВОДОРОДА НА ПРОЦЕССЫ ЭКЗО- И ЭНДОЦИТОЗА СИНАПТИЧЕСКИХ ВЕЗИКУЛ В ДВИГАТЕЛЬНОМ НЕРВНОМ
ОКОНЧАНИИ МЫШИ
© 2012 г. О. Б. Митрухина, А. В. Яковлев, Г. Ф. Ситдикова*
Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008, Казань, ул. Кремлевская, 18; *электронная почта: Guzel.Sitdikova@ksu.ru Поступила в редакцию 24.06.2011 г.
С помощью электрофизиологического и флуоресцентного метода исследовали влияние донора сероводорода (Н2$) — гидросульфида натрия (№Н8) на процессы экзо- и эндоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончании в диафрагмальной мышце мыши. Показано, что №Н$ вызывает увеличение частоты миниатюрных потенциалов концевой пластинки без изменения их амплитудно-временных параметров и амплитуды постсинаптических ответов в условиях одиночной стимуляции (0.3 Гц), что свидетельствует об усилении процессов экзоцитоза синаптических везикул. В условиях высокочастотной стимуляции (50 Гц) на фоне действия №Н$ наблюдалась более существенное снижение секреции медиатора, что может быть связано с замедлением процессов мобилизации синаптических везикул из рециклирующего пула к зонам экзоцитоза. Также приводил к снижению захвата эндоцитозного флуоресцентного маркера FM 1-43, что указывает на замедление процессов эндоцитоза синаптических везикул. Таким образом, донор Н2$ усиливает экзо-цитоз и замедляет процессы эндоцитоза и мобилизации синаптических везикул в двигательном нервном окончании мыши.
Ключевые слова: сероводород, двигательное нервное окончание, освобождение медиатора, экзо- и эндоцитоз.
Сероводород (Н28) относится к новому классу посредников, которые наряду с монооксидом углерода и оксидом азота образуют группу газомедиаторов [1—4]. Эндогенно Н28 образуется из Х-цистеина, ферментами цистатионин-у-лиазой, цистатионин-р-синтазой и меркаптосульфо-трансферазой, которые специфично экспресси-руются в различных тканях [2, 3]. В гиппокампе Н28 облегчает индукцию долговременной потен-циации в ответ на слабую тетаническую стимуляцию [5], а в периферической нервной системе усиливает освобождение медиатора из двигательных нервных окончаний лягушки и мыши [6, 7]. Мишенями Н28 в различных тканях служат АТР-зависимые и кальций-активируемые калиевые каналы, потенциал-активируемые кальциевые каналы Ь- и Т-типа [8, 9], аденилатциклазная система [10, 11].
В синаптических структурах ключевыми этапами секреции нейромедиатора являются экзо- и эндоцитоз синаптических везикул [12, 13]. Процессы от экзоцитоза везикулы до приобретения ею повторной способности к экзоцитозу получили название рециклирования, а постоянный кругооборот везикул в нервном окончании называется везикулярным циклом [13]. Данные о влиянии Н28 на процессы рециклирования синаптических
везикул в условиях высокочастотной активности синапса отсутствуют. Целью настоящей работы было исследование влияния донора Н28 — №Н8 на динамику секреции медиатора и процессы эк-зо- и эндоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончании мыши при длительной высокочастотной стимуляции, выполненное с использованием электрофизиологических и оптических (флуоресцентных) методов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проводили на изолированных нервно-мышечных препаратах диафрагмальной мышцы мыши. Нервно-мышечный препарат выделяли и помещали в ванночку, заполненную стандартным раствором Кребса следующего состава (мМ): NaCl - 137; KCl - 5; CaCl2 - 2.2; MgCl2 - 1; NaHCO3 - 11; NaH2PO4 - 1; глюкоза -11. Перед экспериментом раствор насыщали кар-богеном (95% О2, 5% СО2) (20°С, рН 7.2-7.4). Для блокирования сокращений и потенциалов действия мышечных волокон использовали d-тубо-курарин в концентрации 2-5 мкМ. В экспериментах использовали гидросульфид натрия (NaHS) - донор H2S, в концентрации 200 мкМ
ВЛИЯНИЕ СЕРОВОДОРОДА НА ПРОЦЕССЫ ЭКЗО- И ЭНДОЦИТОЗА
325
(Sigma, США), который в водных растворах образует H2S [5].
Для внутриклеточной регистрации спонтанных и вызванных потенциалов концевой пластинки (ПКП) использовали стеклянные микроэлектроды, заполненные раствором KCl (2.5 М). Для усиления сигналов применяли усилитель с коэффициентом усиления 400 и полосой пропускания фильтра 0—10 кГц, а регистрацию производили с помощью автоматизированной системы, состоящей из АЦП L-CARD 1250 и компьютера Pentium 4. Двигательный нерв раздражали прямоугольными импульсами сверхпороговой амплитуды с частотой 0.3 Гц (одиночная стимуляция) и 50 Гц (высокочастотная стимуляция). Для анализа эффектов NaHS на ПКП или миниатюрные ПКП (МПКП) регистрировали сигналы в контроле (в течение 10—15 мин), затем в перфузируемый раствор апплицировали вещество в течение 20 мин, после чего отмывали стандартным раствором Кребса. В случае высокочастотной стимуляции NaHS присутствовал в растворе в течение 10—15 мин до начала раздражения.
В экспериментах использовали флуоресцентный краситель FM 1-43 (Biotium, США) в концентрации 2 мкМ. Краситель обратимо связывается с пресинаптической мембраной и во время эндоцитоза оказывается внутри вновь образующихся синаптических везикул ("загружается"). При загрузке красителя появляется свечение нервного окончания, отражающее скопления везикул, захвативших краситель [13, 14]. Для исследования процессов эндоцитоза использовали два протокола. В первом FM 1-43 присутствовал в растворе в течение 1 мин во время стимуляции двигательного нерва с частотой 50 Гц, а также в течение 7 мин после ее окончания (полная загрузка); второй протокол подразумевал присутствие красителя в окружающем растворе только в процессе раздражения нерва с частотой 50 Гц в течение 1 мин (загрузка во время стимуляции). После загрузки красителем препарат отмывали в течение 40—60 мин раствором Кребса и затем регистрировали свечение нервных окончаний. Для изучения эффектов H2S на процессы эндоцитоза синаптических везикул нервно-мышечный препарат инкубировали в присутствии донора NaHS в течение 10 мин до начала протоколов стимуляции.
Свечение нервных окончаний наблюдали с помощью микроскопов МИКМЕД-2 (ЛОМО, Санкт-Петербург) или AxioScope A1 (Carl Zeiss, Германия) через водноиммерсионные объективы LUMPLFL 60x/0.9-NA (Olympus, США) и/или Plan-Neofluar 63x/0.9 (Carl Zeiss, Германия). Все наблюдения проводили только на поверхностно лежащих нервных окончаниях. Для регистрации картин флуоресценции использовали быстродействующие черно-белые видеокамеры AxioCam
MRm (Carl Zeiss, Германия). Среднюю интенсивность свечения оценивали в относительных единицах (о.е.) на участке нервного окончания длиной 10—20 мкм, принимая максимальное свечение пикселя, равное 256, за 1. Далее определяли значение фонового свечения как среднюю интенсивность свечения в квадрате 50 x 50 пикселей в участке изображения без нервного окончания. Фоновое значение впоследствии вычитали из каждого пикселя, полученного после усреднения изображения. Все данные обработаны методами вариационной статистики. Количественные результаты представлены в виде — среднее значение ± ± стандартное отклонение, n — число независимых опытов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Аппликация NaHS (200 мкМ) приводила к повышению амплитуды ПКП до 146 ± 7% (n = 7; p < 0.05) в условиях одиночной стимуляции и увеличению частоты МПКП до 200 ± 42% (n = 4; p < 0.05) к 6—10 мин аппликации. При этом амплитудно-временные параметры МПКП не изменялись. Амплитуда МПКП составила 0.48 ± 0.09 мВ (n = 4) в контроле и 0.44 ± 0.09 мВ (n = 4, p > 0.05) при аппликации NaHS. Время нарастания изменялось незначительно: 0.69 ± 0.04 мс (n = 4) в контроле и 0.81 ± 0.08 мс (n = 4,p > 0.05) при действии донора H2S; время спада составило 2.57 ± 0.11 мс и 2.34 ± 0.13 мс (n = 4, p > 0.05) соответственно. Полученные данные согласуются с результатами исследований, проведенных ранее на нервно-мышечном синапсе мыши, и свидетельствуют о том, что NaHS действует на пресинаптическом уровне, вызывая усиление освобождения ацетилхоли-на из нервного окончания [7].
Для исследования динамики секреции медиатора в условиях высокочастотного раздражения использовали стимуляцию с частотой 50 Гц в течение 1 мин. В контроле высокочастотное раздражение двигательного нерва диафрагмальной мышцы мыши сопровождалось характерными изменениями амплитуды ПКП. Первоначальное резкое снижение амплитуды ПКП развивалось в течение первых 10—15 импульсов, которое к концу 1 с стимуляции достигало 48 ± 3% (n = 10, p < 0.05) относительно первого сигнала (рисунок а, вкладка). Затем наблюдался период плато на уровне 32 ± 5% (n = 10, p < 0.05) в течение 25 с стимуляции, после чего амплитуда ПКП медленно снижалась и к концу стимуляции составила 19 ± 3% (n = 10, p < 0.05) (рисунок а). В условиях предварительной аппликации NaHS в концентрации 200 мкМ к 1 с стимуляции амплитуда ПКП составила 43 ± 6% (n = 9, p > 0.05), что не отличалось от контрольных значений (рисунок а, вкладка). Однако затем наблюдали более выраженное снижение ПКП и к 25 с амплитуда ПКП составила 16 ± 2% (n = 9, p < 0.05),
0 10 20 30 40 50 60 "Полная "Загрузка
Время, с загрузка" во время
стимуляции"
Влияние на процессы экзо- и эндоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончании. а — Из-
менение амплитуды ПКП в условиях высокочастотного раздражения (50 Гц, 1 мин) в контроле (черный цвет) и при действии (200 мкМ) (серый цвет). На вкладке представлена динамика амплитуды ПКП в первую секунду сти-
муляции. б — Интенсивность свечения нервных окончаний в контроле (белые столбики) и при действии ^аНЗ (200 мкМ) (заштрихованные столбики) при загрузке нервного окончания красителем FM 1-43 по двум протоколам — "полная загрузка" и "загрузка во время стимуляции" (см. Материалы и методы). Над столбиками показаны примеры черно-белых изображений загруженных красителем нервных окончаний. *р < 0.05
а к 60 с высокочастотной стимуляции — 10 ± 2% (п = 9, р < 0.05) по отношению к контролю (рисунок а).
Согласно опубликованным данным в двигательном нервном окончании мыши работают три везикулярных пула, различающихся по величине, локализации и физиологической роли: немедленно готовый к освобождению; мобилизац
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.