БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 2, с. 214 - 223
УДК 577.112
ВЛИЯНИЕ ШАПЕРОНИНА, КОДИРУЕМОГО ГЕНОМ 146, НА ТЕПЛОВУЮ АГРЕГАЦИЮ ЛИТИЧЕСКИХ БЕЛКОВ БАКТЕРИОФАГА EL P. aeruginosa*
© 2015 П.И. Семенюк1**, В.Н. Орлов1, Л.П. Курочкина12
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, 119991 Москва; факс: +7(495)939-3181, электронная почта: psemenyuk@belozersky.msu.ru, orlovvn@belozersky.msu.ru 2 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997Москва; факс: +7(495)336-6022, электронная почта: lpk@ibch.ru
Поступила в редакцию 17.06.14 После доработки 17.09.14
Продолжено изучение ранее охарактеризованного нами шаперонина, кодируемого геном 146 бактериофага EL Pseudomonas aeruginosa. Для выяснения механизма его функционирования были получены и охарактеризованы новые рекомбинантные белки-субстраты — фрагменты продукта гена (пг) 183, содержащие лизо-цимный домен; исследовано их взаимодействие с пг 146. С помощью динамического светорассеяния исследовано влияние фагового шаперонина на тепловую агрегацию одного из фрагментов пг183 и эндолизина (пг188) как в присутствии, так и в отсутствие АТФ. Показано, что в отсутствие АТФ фаговый шаперонин образует стабильные комплексы с белками-субстратами, тем самым защищая их от тепловой агрегации. Проведен сравнительный анализ экспериментальных данных, полученных на разных белках-субстратах.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: фаговый шаперонин, бактериофаг EL, эндолизин, агрегация белка.
Шаперонины — белки-помощники, осуществляющие сворачивание только что синтезированных полипептидных цепей в функционально активную структуру за счет энергии гидролиза АТФ и подавляющие агрегацию денатурированных в условиях теплового шока белков. Представители этого класса шаперонов были найдены как у бактерий (шаперонины группы I, в том числе наиболее изученный ОгоЕЬ), так и у ар-хей и эукариот (шаперонины группы II), а также в эндосимбионтных органеллах (группа I) [1, 2]. Вирусы же (например, бактериофаги X, Т4 и ЯБ49), как считалось до недавнего времени, используют для сворачивания некоторых своих белков шаперонин ОгоЕЬ клетки-хозяина. В отличие от фага X, использующего бактериальную систему ОгоЕЬ/ОгоЕ8 [3], фаги Т4 [4] и ЯБ49 [5]
Принятые сокращения: ДСК — дифференциальная сканирующая калориметрия; ДСР — динамическое светорассеяние; ИТК — изотермическая титрационная калориметрия; пг — продукт гена; а.о. — аминокислотные остатки.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 14-173, 25.01.2015.
** Адресат для корреспонденции.
кодируют собственные кошаперонины — орто-логи GroES, которые функционируют в паре с «хозяйским» GroEL.
Однако оказалось, что и вирусы бактерий также могут кодировать GroEL-подобные белки [6—9]. Ранее мы впервые получили и охарактеризовали один из представителей этой группы белков — продукт гена (пг) 146 бактериофага EL P. aeruginosa [10]. С помощью различных физико-химических методов нами был изучен ре-комбинантный белок, продуцированный клетками E. coli. Установлено, что по своей архитектуре этот белок похож на бактериальный шапе-ронин GroEL: он состоит из двух колец, содержащих по семь субъединиц, и имеет внутреннюю полость. Используя сыворотку на пг146, методом иммунопреципитации из инфицированных фагом клеток были выделены его комплексы с белками-субстратами и с помощью масс-спектрометрии идентифицирован один из них — пг188 (эндолизин). В опытах in vitro впервые было продемонстрировано, что пг146 выполняет функцию шаперонина: он защищает эндолизин от термической инактивации и подавляет агрегацию развернутых под воздействи-
ем температуры молекул субстрата. Установлено, что фаговый шаперонин может функционировать как АТФ-зависимым, так и АТФ-незави-симым способом [10].
Для дальнейшего исследования фагового шаперонина и выяснения механизма его функционирования в качестве потенциального субстрата был выбран другой белок фага EL. Известно, что для проникновения в клетку грамот-рицательной бактерии P. aeruginosa, а также выхода из нее вновь синтезированных фаговых частиц литический бактериофаг EL использует целый комплекс ферментов с различной субстратной специфичностью. Один из них — ранее охарактеризованный нами эндолизин (пг188) — участвует в клеточном лизисе в конце репликационного цикла фага и необходим для разрушения наиболее труднопреодолимой преграды — пептидогликанового слоя. Другой белок, выполняющий подобную функцию — пг183, содержит лизоцимный домен и ответственен за локальную деградацию пептидогликана при инфицировании фагом бактериальной клетки в начале репликационного цикла EL [6]. Аминокислотные последовательности литических доменов пг188 и пг183 сходства не имеют.
В данной работе были получены и охарактеризованы фрагменты пг183, содержащие лизо-цимный домен, и изучено их взаимодействие с фаговым шаперонином. С целью выяснения механизма функционирования шаперонина было проведено сравнительное исследование влияния пг146 на тепловую агрегацию фрагмента пг183 и эндолизина (пг188) как в отсутствие, так и в присутствии АТФ.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клонирование и экспрессия фрагментов гена 183. Фрагменты ДНК гена 183, кодирующие де-леционные варианты пг183-1 и пг183-2, амплифи-цировали с геномной ДНК фага EL с помощью ПЦР, используя обратный праймер: 5'-taa gat ctc gag att caa acg gac ggt ttt atc gg-3' (подчеркнут сайт рестрикции Xho I) и прямые праймеры: 5'-aaa ttt cat atg gga cgg tcg gat aaa gtt gac-3' и 5'-aaa ttt cat atg tcg gac acc agt cat ttg gat-3' (подчеркнуты сайты рестрикции FauND I), соответственно. Фрагменты гена 183 клонировали в вектор pET-28b(+) («Novagene», США) по FauND I/Xho I и экспресси-ровали в BL21(DE3) E. coli. Трансформанты наращивали в среде 2 х TY, содержавшей 1%-ную глюкозу и канамицин (50 мкг/мл), до А600 = 0,6 (при 37°), после чего осаждали центрифугированием при 2500 g (Megafuge 2.0 R; «Heraeus Instruments», Германия) в течение 10 мин. Осад-
ки ресуспендировали в свежей среде с антибиотиком, затем добавляли изопропил-1-тио^^-галактозид («Хеликон», Россия) до концентрации 1 мМ и инкубировали 3 ч при 37°. Клетки осаждали центрифугированием при 25QQ g 1Q мин.
Очистка рекомбинантных фрагментов пг183. Осадки клеток ресуспендировали в 5Q мМ Tris-HCl-буфере, рН 8,Q, обрабатывали ультразвуком в течение 3—5 мин (по Q,5 мин с перерывом 1—2 мин) с помощью дезинтегратора Virsonic 1QQ («Virtis», США) и центрифугировали при 12 QQQ g («Eppendorf», Германия) в течение 1Q мин для удаления клеточного дебриса. Рекомбинантные белки, содержащие полигистидиновую последовательность на N-конце молекулы, были очищены с помощью металлохелатной хроматографии (His-Select nickel affinity gel, «Sigma», США). Очищенные белки диализовали против 5Q мМ Tris-HCl-буфера, рН 8,Q, и концентрировали центрифугированием на фильтрах Amicon Ultra-15 (MWCO 3QQQQ) («Millipore», США). Концентрацию рекомбинантных белков определяли спект-рофотометрически при 28Q нм, используя теоретически рассчитанные коэффициенты экстинк-ции 32 32Q и 23 84Q М-1 см-1 для пг18З-1 и пг18З-2 соответственно.
Определение ферментативной активности белка. Ферментативную активность фрагментов пг183 определяли, как описано ранее [11], используя в качестве субстрата суспензию клеток PAO 1 P. aeru-ginosa с проницаемой внешней мембраной, полученных в результате обработки хлороформом.
Получение и анализ комплекса пг146 с пг188. Рекомбинантные пг14б и пг188 получали как описано ранее [1Q]. Смесь пг14б (1,5 мкМ) и пг188 (3 мкМ) инкубировали в 5Q мМ Tris-HCl-буфе-ре, pH 7,5, содержавшем 1QQ мМ KCl и 1Q мМ MgCl2, при 45° в течение 1,5 ч. Образцы после центрифугирования (12 QQQ g, 1Q мин) смешивали с 4-кратным буфером для образцов и наносили на градиентный ПААГ (З-б%). Белки разделяли в нативных условиях, используя в качестве буфера 8Q мМ Mops, pH 7,2, с 1 мМ ацетата магния. Иммуноблоттинг проводили как описано ранее [12]. Комплексы антиген-антитело окрашивали 0,02%-ным З,З'-диаминобензидином («Sigma», США).
Динамическое светорассеяние (ДСР). Кинетику тепловой агрегации белков изучали с помощью измерения динамического светорассеяния с использованием прибора ZetaSizer NanoZS («Malvern», Великобритания). Концентрация белка-субстрата во всех экспериментах составляла 3 мкМ. Концентрацию шаперонина варьировали для достижения молярных соотношений субстрат/шаперонин, равных 1 : Q,Q5, 1 : Q,2 и 1 : Q,5. Суммарное время накопления автокорреляци-
онной функции, затраченное на получение каждой точки кривой, составляло 150 с. Экспериментальные кривые были сглажены с использованием быстрого фильтра Фурье в пакете Micro-Cal Origin 7.0.
Для моделирования процесса агрегации субстратов были рассмотрены два различных механизма: диффузионно-ограниченный и реакционно-ограниченный. Рост гидродинамического диаметра агрегатов в первом случае описывался уравнением:
Dh = ДА,о (1 + Kit)1/df,
где Dh0 — диаметр стартовых агрегатов, K1 — кажущаяся константа агрегации, df — фрактальная размерность, равная для белковых систем 1,8 [13, 14], во втором - Dh = Dh,o exp (K2 (t - to)) [15, 16].
Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК). Эксперименты проводили с использованием микрокалориметра ДАСМ-4 («Биоприбор», Россия) с капиллярными платиновыми ячейками, скорость прогрева составляла 1°/мин. В качестве приборной базовой линии использовали повторный прогрев образца в силу необратимости денатурации белков. Обработку данных, в том числе вычитание химической базовой линии, проводили в программе Arina 2, разработанной в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ. Эксперименты проводили в 50 мМ Tris-HCl-буфере, pH 8,0, содержавшем 100 мМ KCl и 10 мМ MgCl2. Концентрация индивидуальных белков в растворе составляла 0,5 мг/мл. При изучении взаимодействия пг146 с субстратом концентрацию шапе-ронина увеличивали до 1 мг/мл.
Изотермическая титрационная калориметрия (ИТК). Взаимодействие шаперонина с денатурированной формой субстрата было изучено с использованием изотермиче
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.