НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 4, с. 293-297
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 591.181:612.822.3
ВЛИЯНИЕ СИСТЕМНОГО ВВЕДЕНИЯ КАРБАХОЛА НА КОНСОЛИДАЦИЮ НАВЫКА ПАССИВНОГО ИЗБЕГАНИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКИ ВЫЗВАННЫХ ОТВЕТОВ ПОЛЯ CA1 ГИППОКАМПА
© 2012 г. Ю. В. Добрякова*, В. А. Маркевич
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН
В работе исследовалось влияние неселективного агониста холинергических рецепторов карбахола (доза 0.1 мг/кг) на синаптическую пластичность гиппокампа в период консолидации следов памяти. Для решения поставленной задачи использовалась методика выработки реакции пассивного избегания темного отсека камеры после предъявления животному в этом отсеке однократного болевого электрического раздражителя. Критерием обучения служило значимое увеличение латентного период входа животного в темный отсек камеры. Электрофизиологические исследования осуществлялись у свободноподвижных крыс. Эффективность синаптической передачи оценивалась на основе анализа изменений фокальных потенциалов (амплитуды и тангенса угла наклона переднего фронта ответа) поля CA1 на стимуляцию коллатералей Шаффера до нанесения болевого электрического стимула, в течение 1.5 ч (период консолидации) и через 24 ч после обучения во время теста на сохранение навыка (retention test). Введение агониста вызывало значимый рост амплитуды фокальных потенциалов поля CA1 гиппокампа у крыс, не подвергавшихся обучению в первые 1.5 ч после инъекции и через 24 ч после первичного помещения в камеру. Однако влияния препарата на выработку навыка пассивного избегания выявлено не было.
Ключевые слова: ацетилхолин, гиппокамп, пассивное избегание, синаптическая пластичность.
Гиппокамп вовлечен в широкий круг процессов связанных с механизмами обучения и памяти [1]. Общепринятой клеточной моделью для изучения этих процессов является долговременное изменение эффективности синаптических связей вследствие развития посттетанической потенциа-ции, обычно регистрируемое в области CA1 гип-покампа в ответ на стимуляцию коллатералей Шаффера [2]. Ацетилхолин, выделяющийся из терминалей холинергических волокон, является одним из ключевых медиаторов модулирующих когнитивные функции и синаптическую передачу в гиппокампе и коре как возможную основу нейросетевых перестроек. Действие ацетилхоли-на и холинергических агонистов в первую очередь обуславливается влиянием на NMDA подтип рецепторов глутамата [3, 4]. Предполагается, что формирование следов памяти связано с увеличением, а их консолидация c уменьшением уровня ацетилхолина в гиппокампе [5].
In vitro показано, что агонисты мускариновых рецепторов вызывают индукцию долговременной потенциации (ДП) глутаматергических синапсов в поле СА1 гиппокампа, антагонисты, на-
* Адресат для корреспонденции: 117485 Москва, ул. Бутлерова д. 5а; тел.: (495) 334-70-00, факс: (499) 743-00-56, e-mail: julkadobr@gmail.com.
оборот, ее подавление [6]. Кроме того, in vivo получены данные, что введение блокаторов мускариновых рецепторов (скополамина и пи-рензепина) нарушает выработку длительной потенциации в области CA1 гиппокампа в ответ на стимуляцию холинергических входов из медиального септума (MS) [7].
Взаимосвязь между активностью холинерги-ческой системы и реконсолидацией следов памяти недостаточно изучена. В работе предпринята попытка изучить вовлеченность ацетилхолина в регуляцию синаптической пластичности гиппо-кампа в период консолидации следов памяти с использованием неселективного агониста М-хо-линорецепторов карбахола.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа проводилась на половозрелых самцах линии Wistar весом 250—350 г. Общее число использованных животных — 34 особи. Эксперименты осуществляли с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/EC) и одобренных комитетом по медицинской этике в соответствии с положением Института ВНД и НФ РАН о работе с экспериментальными животными.
Нейрофизиологическим и поведенческим исследованиям предшествовала хирургическая операция. Животное анестезировали хлоралгидратом (400 мг/кг, в/б) и стереотаксически унилате-рально вживляли биполярные электроды для электрической стимуляции и регистрации ответов. Вживление электродов производили по следующим координатам: поле CA1 гиппокампа — AP 2.7, L —1.5; коллатерали Шаффера — AP 3.0, L —3.0 при положении брегмы и лямбды на одном горизонтальном уровне [8]. Для регистрации и стимуляции использовали биполярные электроды, скрученные из нихромовой проволоки в заводской изоляции диаметром 80 мкм. Глубину погружения стимулирующего и регистрирующего электродов оценивали, исходя из показателей регистрируемого ответа (оптимальное соотношение амплитуды и стимулирующего тока). Электроды фиксировали на черепе животного с помощью быстро-твердеющей пластмассы (протакрил М). Животных тестировали через 7 дней после операции.
Исследование влияния карбахола на формирование навыка пассивного избегания проводилось в установке "темно-светлая" камера. Использованная установка (OpenScience, Россия) представляет собой прямоугольную камеру с двумя отсеками размером 30 х 30 см, окруженными стенками высотой 30 см. При первом тестирования животное помещали в светлый отсек установки и в течение 10 мин оценивали такие показатели как: латентный период входа животного в темный отсек и общее время, проведенное животным в светлом отсеке камеры. При повторном помещении в камеру, при входе в темный отсек крыса получала однократный болевой электрический раздражитель. Электростимуляцию производили ритмическим током частотой 100 Гц. Сила тока определялась опытным путем по появлению реакции избегания. Процедуру тестирования повторяли через 24 ч после предъявления тока. В качестве критерия обучения использовали значимые изменения латентного периода входа животного в темный отсек камеры.
Электрофизиологические исследования осуществлялись у свободноподвижных крыс до получения болевого раздражения, в течение 1.5 ч после обучения (помещения в камеру) (период консолидации) и через 24 ч при проверке сохранения навыка после предъявления электрического болевого стимула.
Для регистрации фокальных потенциалов поля CA1 гиппокампа проводили стимуляцию кол-латералей Шафера прямоугольными импульсами длительностью 50—100 мкс. Применяли серию из 10 предъявлений парных стимулов (интервал между стимулами в паре 30 мс; между парами стимулов — 20 с). Оптимальные параметры тока стимуляции варьировали от 100 до 400 мкА. Эффек-
тивность синаптической передачи оценивалась по изменению амплитудных характеристик вызванных ответов поля CA1 гиппокампа в ответ на тестирующую стимуляцию коллатералей Шафера.
В качестве нейрофармакологического агента использовали агонист холинергических рецепторов карбахол (Sigma, США). Препарат разводили в физиологическом растворе и инъецировали внутрибрюшинно в дозе 0.1 мг/кг (1 мл/кг веса животного) непосредственно после получения животным болевого электрического раздражителя. Контрольные крысы получали эквивалентные объемы растворителя. Для оценки достоверности эффектов препаратов использовали параметрические (Стьюдента) и непараметрические (Ман-на-Уитни, Вилкоксона) критерии, а также двух-факторный ANOVA-метод с одним межгрупповым ("линия" либо "введение препарата") и одним внутригрупповым (повторные измерения в ходе тестирования) факторами.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В ходе анализа влияния карбахола в дозе 0.1 мг/кг на характеристики фокальных потенциалов поля СА1 гиппокампа было протестировано четыре группы животных. В двух из них введению препарата или физраствора предшествовало получение животным однократного электрического болевого стимула. В двух других препарат/физраствор инъецировался внутрибрюшинно без предъявления болевого раздражения.
Показано, что амплитуды ответов фокальных потенциалов поля СА1 гиппокампа у животных получавших инъекции карбахола (0.1 мг/кг), стабильно увеличены по сравнению с контролем в первые 90 минут после введения препарата ^(1.17) = 6.03, р < 0.05; АМОУА-метод; повторные измерения 0—90 мин; рис. 1). Наиболее выраженные отличия наблюдались с 20-й по 40-ю минуту регистрации (увеличение в среднем на 10%, р < 0.05 по критерию Стьюдента) (рис. 2).
Значимых межгрупповых различий в формировании навыка пассивного избегания по изменению времени латентного периода входа в темный отсек камеры выявлено не было (рис. 3). Через 24 ч после обучения в обеих группах крыс, получавших однократный болевой раздражитель, наблюдался достоверный рост латентного периода входа в темный отсек камеры. У животных после обучения получавших инъекцию карбахола зарегистрировано увеличение показателя с 37 ± ± 15.3 до 256.3 ± 93.4 с (р < 0.05). В группе с обучением без карбахола также отмечен достоверный рост латентного периода входа в темный отсек темно-светлой камеры с 38.8 ± 11.4 до 262 ± 97.5 с (р < 0.05).
ВЛИЯНИЕ СИСТЕМНОГО ВВЕДЕНИЯ КАРБАХОЛА
295
Амплитуда ответа в % от фонового уровня 115 г- —♦— контоль n = 9
- ■ - карбахол (0.1 мг/кг) n = 10
*# т
110
105
*#*#_# т I
Ï--ÎÀI
100
95
90
10 20 30 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
время, мин
Рис. 1. Изменение амплитуды фокальных потенциалов поля CA1 гиппокампа в ответ на тестирующую стимуляцию коллатералей Шафер в течение 90 мин после введения карбахола в дозе 0.1 мг/кг. По оси абсцисс — время тестирования, по оси ординат — амплитуда ответа в процентах от фонового уровня (представлены AM ± SEM). Значимые отличия (p < 0.05) отмечены: * — при оценке межгрупповых отличий, # — при сравнении одной и той же группы животных до и после введения карбахола.
Исследование изменений фокальных потенциалов поля CA1 гиппокампа через 24 ч после введения препарата показало увеличение амплитуды и тангенса угла наклона переднего фронта вызванных ответов поля CA1 гиппокампа, как до, так и после помещения в темно-светлую камеру, где происходило обучение. В группе крыс, получавших карбахол в дозе 0.1 мг/кг и не подвергавшихся обучению, через 24 ч после инъекции амплитуда ответов была значимо выше (119.3 ± ± 7.2%; p < 0.05 по критерию Стьюдент
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.